岳 军，屈海峰，胡世洋，徐友海，宁艳春，惠继星，王继艳，金 刚

（中国石油吉林石化公司研究院，吉林吉林132021）

自人类进入工业社会以来，资源环境问题日益突出，尤其是不可再生的化石能源的大量使用，排放大量二氧化碳所导致的温室效应，已经成为不可回避的重大问题[1]。能源与资源的可再生化与环境友好化是未来转型升级的方向。

2017年9月13日,国家发改委、国家能源局、财政部等十五部委联合印发《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》，根据方案要求，到2020年，我国全国范围将推广使用车用乙醇汽油，到2025年，力争纤维素乙醇实现规模化生产，该方案的出台对于纤维素乙醇的推广有重大的意义。

木质纤维素材料是光合作用的产物，产量巨大而且可再生，可以用作生产液体燃料的原料，成为化石能源的潜在替代品，受到了全世界的广泛关注[2-3]。目前，以农作物秸秆为代表的木质纤维素材料，由于没有合适的应用途径，大多以堆积、焚烧等形式直接处理，不仅资源浪费，而且造成了严重的环境问题，引起了公众的密切关注[4-5]。以木质纤维素生产燃料乙醇是解决秸秆焚烧以及减少二氧化碳排放的有效途径。以玉米秸秆为原料制备燃料乙醇为例，与同等体积的汽油相比，二氧化碳排放量要减少70%以上[6]。

木糖渣是玉米芯提取木糖后的废渣，其纤维素含量可以达到60%～70%之间，由于大部分半纤维素已经被脱除，纤维素的转化率大幅度的提高，可以作为发酵产乙醇的原料[7-8]。但是与淀粉质原料相比，使用木质纤维素材料发酵产乙醇还存在诸多的问题，其中之一便是发酵醪液中的乙醇浓度较低，蒸馏过程中的能耗大[9]。木糖渣作为玉米芯生物炼制的典型材料，其应用模式对于其他农作物秸秆而言具有一定的借鉴意义。已有文献研究了木糖渣发酵产乙醇的过程，取得了一定的效果，但还存在诸如发酵周期长、乙醇浓度低的问题；有研究以水解液作为发酵原料，虽然可缩短发酵周期，但操作过程较为繁琐[10-11]。因此仍需对木糖渣发酵生产乙醇的过程进行进一步研究，提高发酵醪液中的乙醇浓度。

本研究以木糖渣为原料，研究了底物浓度、酶用量对于乙醇浓度的影响，在此基础上，采用补料发酵进一步提高底物浓度，研究了不同补料次数、补料量对于乙醇浓度的影响，对于木糖渣生产燃料乙醇的进一步推广具有一定的借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料

木糖渣：山东龙力生物科技有限公司，自然风干后，储存于自封袋中，平衡水分24 h后备用。

纤维素酶：上海宝曼生物科技有限公司，滤纸酶活162.7 FPU/g，β-葡萄糖苷酶酶活40.9 IU/g。

酿酒活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；实验过程中所用的酵母粉、蛋白胨为生化试剂，乙醇、浓硫酸等化学试剂皆为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 同步糖化发酵

将1.0g干酵母及100mL无菌水分别置于300mL三角瓶中，于30℃、180 r/min下活化2 h。活化结束后，取5 mL酵母活化液接入300 mL装有已灭菌木糖渣的三角瓶中（三角瓶中除含有木糖渣外，还包括45 mL含有10.0 g/L蛋白胨、5.0 g/L酵母抽提物的水溶液），并按照实验所需酶用量加入纤维素酶，用锡箔纸封口后，于30℃、180 r/min下进行同步糖化发酵，测定乙醇浓度，并计算纤维素转化率，公式如下。

1.2.2 半同步糖化发酵

称取5 g木糖渣于250 mL三角瓶中，加入45 mL去离子水，0.5 g蛋白胨及0.25 g酵母抽提物，121℃灭菌并降至室温后，向三角瓶中加入纤维素酶。锡箔纸封口后将三角瓶置于50℃振荡培养箱中，以180 r/min酶解糖化48 h，每隔24 h取样并进行补料，采用高效液相色谱(HPLC)测定水解液中葡萄糖的浓度。48 h后将温度设置为30℃，三角瓶温度降至室温后，加入酵母活化液5 mL，放置于30℃培养箱中进行补料同步糖化发酵，期间每隔24 h取样，并分析样品中的葡萄糖及乙醇浓度。

1.2.3 分析和测定方法

木糖渣化学组分的测定：木糖渣中水分、木质素、纤维素等组分含量按文献中所述方法进行测定[12]。

酶解液或发酵液中葡萄糖和乙醇浓度的测定：吸取木糖渣水解液或是发酵液，以10000 r/min离心5 min后，用去离子水将上清液稀释到一定倍数，采用液相色谱进行测定。

高效液相色谱分析条件：仪器LC20A(日本岛津)，流动相：0.005 mol/L硫酸溶液，色谱柱bio-rad HPX 87H，流速：0.6 mL/min，柱温：55 ℃，检测器：RID 10A。

2 结果与讨论

2.1 酶用量影响

将纤维素转化为可发酵性糖的过程中，纤维素酶起着关键作用。如何降低酶水解过程中纤维素酶的成本是纤维素乙醇大规模商业化生产需要解决的问题之一。酶的现场生产以及开发更高效的酶制剂是有效的解决方案[13-14]，而对于特定底物而言，研究酶用量的影响，在保证较高转化率的前提下，尽量减少纤维素酶的用量也可以在一定程度上降低酶用量。

以木糖渣为底物，发酵底物浓度为10 g/100 mL，纤维素酶在发酵初期添加，采用同步糖化发酵，对比了不同酶用量对乙醇浓度的影响，结果见图1。图1表明,在不同的发酵时间点，发酵液中的乙醇浓度随着酶用量的增加而相应增加。酶用量由15 FPU/g底物增加到35 FPU/g底物，发酵24 h乙醇浓度由8.3 g/L增加到24.4 g/L，发酵48 h乙醇浓度由19.0 g/L增加到31.0 g/L，发酵72 h乙醇浓度由22.5 g/L增加到32.0 g/L。当酶用量由20 FPU/g底物增加到35 FPU/g底物，发酵时间分别为24 h与48 h时，发酵液中的乙醇浓度差异明显；发酵时间分别为48 h与72 h时，乙醇浓度的差异不大，表明发酵48 h时大部分纤维素已经被降解为酵母可以利用的发酵性糖，并被进一步转化为乙醇。因此当底物浓度为10 g/100 mL时，酶用量达到20 FPU/g底物以上，发酵时间以48 h较为适宜。

采用origin8.0对发酵48 h时，酶用量与乙醇浓度进行了拟合，结果如图2所示，拟合方程为y=-0.028x2+1.988x-3.929（其中y为乙醇浓度，x为酶用量），拟合模型的p值为0.02，相关系数R2为0.955表明该方程拟合良好，可以对结果进行很好的预测。

图1 酶用量对乙醇浓度的影响

图2 发酵48 h酶用量与乙醇浓度的拟合

2.2 底物浓度的影响

在乙醇蒸馏过程中，乙醇浓度对于蒸馏能量的消耗有显著性的影响，当发酵液中乙醇体积分数低于5%时，蒸馏过程中消耗的能量将大大增加，为了降低蒸馏过程中的能耗，发酵液中的乙醇浓度需要增加到5%以上[15]。由于木质纤维素类物质密度小，吸水性强，纤维素酶水解效率低，显然提高底物浓度以增加发酵液中的乙醇浓度是必然选择[16]。

以木糖渣为底物，酶用量为20 FPU/g底物，对比了底物浓度分别为5.0 g/100 mL、10.0 g/100 mL、15.0 g/100 mL、20.0 g/100 mL对乙醇浓度的影响，结果见图3。从图3可以看出，在上述底物浓度下，发酵时间由48 h增加到72 h时，乙醇浓度变化较小，表明在底物浓度不变的情况下，发酵48 h即可。当底物浓度由5.0 g/100 mL增加到20.0 g/100 mL时，各发酵时间点乙醇浓度呈逐渐增加的趋势，发酵96 h时乙醇浓度分别为12.1 g/L、29.0 g/L、38.5 g/L、37.5g/L。底物浓度由5.0g/100mL增加到15.0g/100mL时，乙醇浓度增加较多，而底物浓度由15.0 g/100 mL增加到20.0 g/100 mL时，每个发酵时间点的乙醇浓度均相差不大。单位底物酶用量相同，底物浓度增加到20.0 g/100 mL情况下，乙醇浓度增加较少，原因可能是在底物浓度为20.0 g/100 mL时，发酵液的黏度过大，传质效率下降。进一步比较了96 h时，4种底物浓度下，纤维素转化率的变化，结果见表1。由表1可知，当底物浓度增加到20.0 g/100 mL时，转化率已经由最高的87.1%下降到了56.3%,表明单位底物酶用量相同时，底物浓度增加后转化率下降。此外还发现，与酶用量对乙醇浓度影响的结果相类似，当底物浓度固定不变时，发酵48 h乙醇浓度已经接近最高值（图3），从提高发酵效率角度来看，发酵48 h较为适宜。

图3 底物浓度对乙醇浓度的影响

表1 发酵96 h底物浓度与纤维素转化率的对比

2.3 补料次数的影响

纤维素乙醇发酵过程中，由于一次性加料容易造成底物浓度过高而导致传质效率的下降，在发酵起始时底物浓度不宜过高。实现纤维素乙醇发酵的高乙醇浓度，需要在发酵过程中分批次添加发酵底物，从而逐步增加底物浓度。

以木糖渣为底物，酶用量为20 FPU/g底物，纤维素酶在发酵初始时添加，起始底物浓度为15.0 g/100 mL，对比了补料次数对乙醇浓度的影响，结果见图4。补料次数分别为1～5次，补料间隔时间为24 h，每次补相同质量的木糖渣，120 h时所有试验组中的总底物浓度均达到30.0 g/100 mL，具体补料情况见表2。从图4可看出,发酵时间分别为24 h、48 h、72 h时各试验组的乙醇浓度相差不大。发酵120 h时各补料试验组的乙醇浓度均达到最大，其中最高的是补料次数为2次的试验组，乙醇浓度达到70.0 g/L。为了进一步研究补料次数对乙醇浓度的影响，对不同发酵时间下补料次数对乙醇浓度的影响进行了方差分析，结果见表3。从表3可以看出，发酵时间从24 h延长到192 h，p值均大于0.05，表明在起始底物浓度一致、酶用量相同、终补料浓度相同的情况下，分别进行不同次数的补料对乙醇浓度并没有显著性的影响。

图4 补料次数对乙醇浓度的影响

表2 不同补料次数的补料操作情况

为了进一步的对比不同补料次数对乙醇发酵的影响，分析了在不同发酵时间点、补料次数对转化率的影响，结果见图5。从图5可以看出，发酵时间分别为48 h、72 h时，随着补料次数的增加，转化率也随之增加，以发酵72 h为例，转化率最高的是补料次数为5次的试验组，其转化率为67.3%，随着补料次数的减少，转化率依次为65.2%、58.6%、52.2%、51.2%。

表3 补料次数对乙醇浓度影响的方差分析

图5 补料次数对转化率的影响

进行1次补料，24 h其纤维素转化率为45.8%，24 h补料后，48 h转化率降低到37.8%，48 h之后逐渐上升；进行2次补料，补料时间分别在24 h、48 h，其相应的转化率为38.8%、53.5%，72 h时转化率为52.1%；进行3次补料，补料时间分别为24 h、48 h、72 h，其相应的转化率为42.2%、56.2%、58.6%，96 h时转化率为56.2%。从所列举的数据可以看出，补料次数分别为第1次及第2次时补料后的转化率有所下降，其中的原因是，补料后底物的量增加速度过快，而纤维素酶水解纤维素的速度随着时间的延长而逐渐下降[17]，增加的底物并不能很快的被纤维素酶降解成酵母可利用的葡萄糖。当补料次数为4次与5次时，96 h之前转化率是逐渐增加的，96 h之后呈下降趋势，所补的底物已不能被完全酶解，若发酵时间延长至144 h之后，补料次数对于转化率的影响不显著。

2.4 补料量的影响

以木糖渣为底物，起始浓度为15.0 g/100 mL，纤维素酶的用量为15 FPU/g底物，24 h后进行补料，具体补料的情况见表4，补料后总底物浓度分别为40.0 g/100 mL、50.0 g/100 mL、52.5 g/100 mL，研究了不同补料量对乙醇浓度的影响，结果见图6。从图6可以看出，发酵时间96 h，3种补料量的乙醇浓度差异不大，96 h之后乙醇浓度有所下降，下降最大的是底物浓度为50.0 g/100 mL、52.5 g/100 mL的试验组，发酵168 h时乙醇浓度仅为53.2 g/L、51.5 g/L。

表4 不同补料量的补料操作情况

图6 补料量对乙醇浓度的影响

值得注意的是3种底物浓度下，发酵液中的葡萄糖均呈上升趋势。发酵168 h时，葡萄糖浓度分别为9.0 g/L、19.4 g/L、20.8 g/L，表明在发酵后期，酵母活性下降，不能将酶水解产生的葡萄糖转化为乙醇。原因可能是补料后，随着酶水解的进行，酚类物质逐渐被释放出来，其浓度不断增加，抑制了酵母活性[18]。

进一步比较了酶用量为20 FPU/g底物，总底物浓度为40.0 g/100 mL的乙醇发酵情况，酶用量由15 FPU/g底物增加到20 FPU/g底物时，96 h乙醇浓度由64.9 g/L增加到75.8 g/L。发酵168 h时葡萄糖也有积累，浓度为7.8 g/L（图6）。

2.5 木糖渣的半同步糖化发酵

由于纤维素酶酶解木质纤维素材料的最适温度与酵母生长最适温度的差异性，同步糖化发酵时，温度只能为适宜于酵母生长的温度。在此条件下纤维素酶的水解效率较低，高底物浓度的纤维素乙醇发酵过程中，会降低纤维素的转化率并延长发酵时间。半同步糖化发酵，首先进行预糖化，预糖化一段时间后，进行同步糖化发酵。此发酵方式，将分步糖化发酵与同步糖化发酵两种方式的优点结合起来，可在一定程度上避免因发酵温度低而造成的纤维素转化率下降的问题，可以提高纤维素的转化率并缩短发酵的周期[19]。

以木糖渣为底物，酶用量为20 FPU/g底物，起始底物浓度为15.0 g/100 mL，首先于50℃下进行预糖化48 h，后进行补料同步糖化发酵，补料情况见表5。半同步糖化发酵情况见图7。图7表明，预糖化24 h时，葡萄糖浓度为13.1 g/L，48 h时葡萄糖浓度为14.4 g/L。依照理论值计算，预糖化24 h时，乙醇浓度仅能达到6.7 g/L，而相应条件下的同步糖化发酵24 h时的乙醇浓度可以达到20.0 g/L以上（图4、图6数据）。预糖化48 h时接种酵母，于30℃进行同步糖化发酵，96 h时的乙醇浓度为16.9 g/L，而同步糖化发酵96 h时的乙醇浓度可以达到50.0 g/L以上（图4、图6数据），半同步糖化发酵效果不佳。与同步糖化发酵相比，采用预糖化并没有增加体系中的葡萄糖浓度，具体原因还有待进一步的分析。而文献报道中，采用半同步糖化发酵可以有效提高纤维素的转化率及乙醇浓度[18-21]，本试验以木糖渣的研究中并没有取得与文献报道相一致的结果。

表5 半同步糖化发酵补料操作情况

3 结论

图7 半同步糖化发酵

3.1 纤维素酶用量与底物浓度相同的情况下，发酵48 h时，乙醇浓度可以达到较高的水平；酶用量为20 FPU/g底物，底物浓度为15.0 g/100 mL与20.0 g/100 mL，乙醇浓度差异不明显。

3.2 底物浓度大于10 g/100 mL时，单位底物酶用量保持不变，底物浓度继续增加后纤维素转化率下降。

3.3 酶用量为20 FPU/g底物，起始底物浓度为15.0 g/100 mL，通过不同的补料次数（1～5次），补料到最终底物浓度为30.0 g/100 mL时，在95%置信水平，补料次数对乙醇浓度没有显著性影响。

3.4 酶用量为15 FPU/g底物，起始底物浓度为15.0 g/100 mL，通过增加补料量到40.0 g/100 mL、50.0 g/100 mL、52.5 g/100 mL，乙醇浓度并不能随着底物浓度的增加而增加。不同补料量下，在96 h时乙醇浓度达到最大，96 h后发酵液中的葡萄糖浓度不断增加。酶用量为20 FPU/g底物时，补料到最终底物浓度为40.0 g/100 mL，96 h时乙醇浓度达到75.8 g/L。

3.5 本研究的实验条件下，与同步糖化发酵相比，半同步糖化发酵乙醇浓度明显低于同步糖化发酵，半同步糖化发酵不能提高乙醇浓度及纤维素转化率，其中原因还有待进一步研究。

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