吴海洋， 李志中， 高绪慧， 武 梅， 王晓茹， 吴郡熹， 秦立廷

(山东新希望六和集团有限公司， 山东 青岛 266101)

自2006 年以来，我国北京、河北、山东等地区的樱桃谷鸭群陆续发生了以软脚和脾脏坏死为特征的疾病。 随后，经过对该病病原的分离和鉴定，确定为呼肠孤病毒感染。 本试验从山东潍坊地区1 例患有脾脏坏死的樱桃谷种鸭体内分离病毒，通过分子生物学方法和动物回归试验进行病原鉴定，判定引起此次樱桃谷种鸭脾脏坏死的病原为鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus， DRV)。 基因序列分析表明，该分离株的扩增片段与已有鸭源呼肠孤病毒的序列同源性较高，均在90%以上。 报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源 病料来自山东潍坊地区疑似患有脾脏坏死的某樱桃谷种鸭养殖场。 无菌采集8日龄病死鸭的肝脏、脾脏，按1∶3的比例加入灭菌的生理盐水，充分研磨匀浆后反复冻融3 次，8 000 r/min(4 ℃)离心5 min，取上清液， -20 ℃保存备用。

1.2 病毒分离与传代 将处理好的病料经卵黄囊接种6 日龄的鸭胚，置于37 ℃孵化观察。 收获死亡鸭胚的尿囊液继续盲传3 代，将收获后的尿囊液置于-80 ℃保存备用。

1.3 序列测定与分析 根据DRV S2 基因的序列，设计合成 了1 对引 物：F： 5′-GCATGAACATGCCAGTTGAG-3′；R：5′-AAGCCATAACGATGGCAGTC-3′，目的片段大小为300 bp。 利用设计的引物对获得的尿囊液进行RT-PCR 扩增，扩增产物经克隆转化后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。应用DNAStar 软件对测序结果进行序列同源性分析并绘制遗传进化树。

1.4 动物回归试验 将40 只7 日龄樱桃谷商品肉鸭随机分成2 组，20 只/组，通过肌肉注射第3 代的病毒尿囊液，0.5 mL/羽。 阴性对照组注射灭菌生理盐水，0.5 mL/羽。 连续观察7 d，记录试验鸭发病及病变情况。 试验结束后，剖检未死亡鸭，采集其肝脏和脾脏进行病毒再分离，利用RT-PCR 方法进行鉴定。

2 结果

2.1 疾病流行情况及临床症状 2017 年10 月份，山东潍坊地区某种鸭场8 日龄种鸭突然发病，发病鸭主要表现为瘫痪，排白色稀便，生长发育不良。鸭群发病率为10%，死亡率为4%。 剖检病死鸭可见，心肌出血，肝脏肿大，有大小不等的白色坏死灶、脾脏肿大、出血，表面有黄色坏死(如中插彩版图1)。

2.2 病毒分离 将经过无菌处理的病料上清液通过卵黄囊接种6 日龄鸭胚，收获尿囊液(命名为SG株)。 盲传3 代后，鸭胚的死亡时间稳定在140 h ～150 h 之间，对照组均未出现死亡。 死亡鸭胚表现为胚体水肿，表面有点状出血(如中插彩版图2)。

2.3 序列测定与分析 应用PT -PCR 方法从SG株扩增出1 条300 bp 的条带，与目的条带相符(如图3)。 将该片段与已有的DRV 序列进行比对，发现其同源性较高，均在90%以上(如图4A)。

图3 鸭呼肠孤病毒S2 基因的扩增

将SG 株S2 基因与GenBank 中已有的番鸭源呼肠孤病毒和北京鸭源呼肠孤病毒的S2 基因序列进行比对，分析其遗传进化关系。 结果表明，SG 株与北京鸭源呼肠孤病毒亲缘关系较近，与番鸭呼肠孤病毒关系较远，处于不同的分支(如图4B)。

2.4 动物回归试验 试验组雏鸭于攻毒后3 d 开始发病，表现精神沉郁，第4 天部分鸭子开始出现瘫痪，第5 天、6 天各死亡1 羽(如中插彩版图5 A)，整个试验期死亡率为10%(2/20)。 对照组试验鸭在整个试验期内均未表现异常。

图4 SG 株S2 基因同源性和遗传进化分析

攻毒后7 d，剖杀试验组幸存鸭和对照组鸭子，可见试验组幸存鸭肝脏肿大有白色坏死灶(如中插彩版图5 C)，脾脏肿大，有黄豆大小的黄色坏死灶(如中插彩版图5 E)，对照组鸭子均无明显病变(如中插彩版图B、D)。

3 讨论

3.1 DRV 感染最早发生于南非[1]，直到1972 年法国学者才从患病番鸭体内分离到第1 株病毒[2]。近几年，我国流行的DRV 感染主要表现为多脏器坏死、多脏器出血和脾脏坏死3 种不同的致病型。 由于DRV 主要侵害雏鸭，并能引起病鸭生长迟缓等症状，给我国养鸭业造成了巨大经济损失。 2006 年，我国北京、河北、山东等地樱桃谷鸭和北京鸭发生的以脾脏和肝脏坏死为特征的疾病，经过对其病原学进行研究，确定为DRV 感染[3-4]。 本试验从主要表现肝脏和脾脏不规则坏死和出血、心肌出血的樱桃谷种鸭脏器中分离到病毒，经鉴定为DRV 感染，与之前报道一致。 Ning Li 等研究表明[5]，DRV 对樱桃谷肉鸭具有致病作用，同样表现为脾脏和肝脏坏死。 本试验将分离株感染雏鸭，结果能够复制出与自然感染病例相同的病变，并能致死雏鸭，死亡率为10%，比黄瑜等[6]报道的死亡率高，这可能与不同毒株之间致病力不同有关。 已有研究表明，禽呼肠孤病毒可以经卵垂直传播[7]。 胡薛英等通过建立SPF 鸡胚DRV 感染模型，怀疑DRV 能在鸡群中垂直传播[8]，本试验从发病樱桃谷种鸭中分离到病毒，说明DRV 可以感染种鸭并引起发病，所以推测现在流行的致肉鸭脾脏坏死的DRV 感染可能是由病毒垂直传播造成。

3.2 对SG 株病毒S2 基因序列同源性分析结果表明，SG 株序列与以前分离到的病毒同源性均较高，在90%以上。 进一步分析发现，SG 株与发生于北京、山东等地的引起樱桃谷肉鸭脾脏坏死的DRV 基因同源性最高，与主要流行与我国南方地区的MDRV 同源性相对较低。 但是，需要注意的是，SG株与从番鸭分离到的J18 株基因同源性较高，亲缘关系较近，说明现在流行于山东鸭群中的DRV 可能发生了变异。