安 冬， 王 军， 刘红羽， 燕晓晓， 吕文发

(吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林 长春 130118)

奶牛乳腺炎是我国乃至全世界内影响奶牛业发展的一种重大疾病，对我国奶牛业造成严重的经济损失。 病原菌是导致乳腺炎炎症反应发生的主要因素之一，预防和治疗奶牛乳腺炎并保障奶业食品安全现已经成为奶牛业面临的主要问题。 因脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞的炎症反应与病原菌感染的乳腺炎反应十分相似，而被广泛采用建立炎症模型[1-3]。 近年来，有研究表明表观遗传学参与炎症反应[4-6]，DNA 甲基化是指不改变DNA 的序列，在DNA 甲基化转移酶的作用下DNA 分子上添加甲基，进而调节基因表达的一种表观遗传调控，已有研究显示，DNA 甲基化调节炎症因子[7-9]。 IL-6、BNBD-5 和TNF-α 均参与多种炎症反应，且参与乳腺上皮细胞炎症反应[10-12]。本试验选用Quantitative Real-time PCR (qRT-PCR)、ELISA 法检测炎症因子的表达量，建立奶牛乳腺上皮细胞的炎症模型，随后添加不同浓度的5-AZA，qRT-PCR 检测TNF-α 的mRNA 表达水平，明确DNA 甲基化是否参与LPS 诱导的奶牛乳腺上皮细胞TNF-α 的表达上调。

1 材料与方法

1.1 主要药品及试剂 DMEM-F12 培养液和胎牛血清等购自于GIBCO，5-AZA、DMSO、LPS、胰岛素、皮质醇等购自于Sigma；反转录、qRT-PCR 试剂盒等购于Takara；TRizol Reagent 购自于Invitrogen；MTT 试剂盒购于上海碧云天生物公司；奶牛乳腺上皮细胞由王涛老师提供[13]。

1.2 炎症模型建立 取铺满培养皿80%的传代细胞，弃培养液，用PBS 冲洗细胞3 遍，添加胰蛋白酶-EDTA 混合液；当大部分细胞处于回缩变圆的状态时，添加含有胎牛血清、双抗、胰岛素和皮质醇的DMEM/F12 完全培养液中停止消化，使细胞再次悬浮，均分到新培养皿在37 ℃二氧化碳培养箱中培养。 培养12 h 后，用0 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL和100 μg/mL 的LPS 分别处理细胞6 h、12 h、24 h后，收集细胞，检测奶牛乳腺上皮细胞TNF-α 表达。

1.3 5-AZA 处理检测 细胞培养12 h，用0 μmol/L、1.0 μmol/L、2.5 μmol/L 和5.0 μmol/L 的5-AZA分别处理细胞24 h、48 h、72 h，LPS 处理，收集细胞，检测奶牛乳腺上皮细胞TNF-α 表达。

1.4 qRT-PCR qRT-PCR 检测炎症因子的mRNA的表达量，比较炎症因子的变化。

1.4.1 总RNA 提取 取出培养细胞的培养皿，用预冷的PBS 冲洗培养皿底部3 次；采用Trizol 法提取总RNA，加入DEPC 水溶解，测定RNA 浓度及OD260/280 值。

1.4.2 RNA 反转录 反转录反应根据Takara 公司PrimeScriptTMRT reagent Kit 说明书，确定检测的体系与程序进行操作。

1.4.3 引物设计 通过基因序列进行引物设计，合成是由上海生工生物股份有限公司完成，信息见下表1。

1.4.4 qRT-PCR qRT-PCR 反应由SYBR Green 荧光染料进行，根据Takara 公司SYBRTMPremix Ex Taq TMⅡ(Tli RNaseH Plus)说明书，确定检测的体系与程序。 反应体系与程序：dH2O 6 μL，SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2 ×) 10 μL， 上下游引物0.8 μL，ROX Reference Dye II(50 ×) 0.4 μL，DNA 2 μL；95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，退火温度，34 s，40 个循环；95 ℃，15 s， 60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。 qRTPCR 反应在qRT-PCR 仪中进行， 得出结果由2 -△△Ct法进一步分析。

表1 引物序列

1.5 MTT 检测细胞活性 取对数期细胞，调整细胞浓度进行培养；对细胞进行DMSO 或1.0 umol/L、2.5 umol/L 和5.0 umol/L 的5-AZA 处理，吸取上清液根据碧云天MTT 试剂盒说明书进行操作；测定490/570nm OD 值。

1.6 数据统计分析 通过SPSS 软件对结果进行数据单因素方差分析，统计学上无显著差异为P ＞0.05，差异显著性为 P ＜0.05，差异极显著为P ＜0.01。

2 结果

2.1 奶牛乳腺上皮细胞中IL-6、BNBD-5、TNF-α 的mRNA 的表达水平 结果如中插彩版图1、图2 和图3 所示，1 μg/mL、10 μg/mL 和100 μg/mL 的LPS分别处理6 h、12 h、24 h 后，IL-6、BNBD-5、TNF-α 的mRNA 表达水平相对于空白对照组均有所提高，其中1 μg/mL 的LPS 处理24 h 时，BNBD-5 的mRNA表达量变化无显著差异(P ＞0.05)，而IL-6 的mRNA 表达量变化差异显著(P ＜0.05)，其余表达量变化均差异极显著(P ＜ 0.01)。 当1 μg/mL 的LPS 处理6 h 时，IL-6、BNBD-5、TNF-α 的mRNA 表达水平相对于对照组均差异极显著(P ＜0.01)。

2.2 奶牛乳腺上皮细胞中TNF-α 的浓度 选用ELISA 法检测LPS 处理对奶牛乳腺上皮细胞上清液中TNF-α 蛋白表达水平的影响。 结果如中插彩版图4 所示，1 μg/mL、10 μg/mL 和100 μg/mL 的LPS 分别处理6 h、12 h、24 h，TNF-α 的蛋白水平相对于空白对照组均有所上升，且差异极显著(P ＜0.01)。

2.3 奶牛乳腺上皮细胞的活性 选用MTT 法检测5-AZA 对奶牛乳腺上皮细胞的活性影响。 结果如中插彩版图5 所示，相对于对照组，添加DMSO 或者1.0 μmol/L、2.5 μmol/L 和5.0 μmol/L 的5-AZA对细胞的活性无显著影响，说明5-AZA 的处理效应不是因改变细胞活力导致。

2.4 5-AZA 对奶牛乳腺上皮细胞中TNF-α 的mRNA 表达水平的影响 结果如中插彩版图6 所示，相对于空白对照组TNF-α 的mRNA 表达量，DMSO处理组无显著差异，LPS 处理组均出现极显著差异；而用1.0 μmol/L、2.5 μmol/L 和5.0 umol/L的5-AZA 分别处理细胞24 h、48 h、72 h，相对于空白对照组、DMSO 处理组和LPS 处理组，TNF-α 的mRNA 表达水平均有显著提高。

3 讨论

近几年广泛应用LPS 处理奶牛乳腺上皮细胞建立炎症模型，通过炎症因子的表达量变化确定炎症模型的建立。 本研究通过IL-6、BNBD-5 和TNF-α确立炎症模型建立成功。 以往研究显示，LPS 处理可诱导细胞IL-6、BNBD-5 和TNF-α 等炎症因子表达上调[10]，但其机制目前尚不清楚。 本研究结果显示，LPS 可上调牛乳腺上皮细胞TNF-α 表达，而经DNA 甲基化抑制剂处理后，TNF-α 表达进一步上调，表明DNA 甲基化参与LPS 诱导的牛乳腺上皮细胞TNF-α 表达上调。

有关研究表明，经LPS 处理后，成纤维细胞的IL-6 和TNF-α 的mRNA 表达量显著上升[12]，乳腺上皮细胞的IL-6 和TNF-α 的mRNA 表达量也显著增加[10-11]。 这与本试验的结果一致，LPS 处理，可显著提高奶牛乳腺上皮细胞的IL-6、BNBD-5 和TNF-α 的mRNA 的表达量。 郭尧的研究发现[14]，1 ug/ml LPS处理奶牛乳腺上皮细胞4h 或6h，TNF-α 的表达量显著上升，与本试验相符。 LPS 浓度为1 ug/ml 、处理6 h 时 IL-6、 BNBD-5、 TNF-α 表 达 量 均 极 显著上升。

DNA 甲基化通常是两种方式，一是聚集DNMT-1，在DNA 复制的过程中维持DNA 链甲基化，一是聚集DNMT-3a 和DNMT-3b，催化DNA 链甲基化[15]。 5-AZA 通过抑制DNA 甲基化转移酶抑制DNA 甲基化。 有研究表明DNA 甲基化参与人骨髓干细胞和人单核细胞的免疫调节，且参与TNF-α 的表达上调[9，14]，与本试验结果一致。 本试验首次发现，DNA 甲基化参与LPS 诱导奶牛乳腺上皮细胞TNF-α 的表达，可能通过降低TNF-α 的甲基化水平提高LPS 诱导的基因表达量，也可能是对TNF-α 上游因子甲基化调控而提高其表达量，具体机制尚不可知，有待下一步深入研究。 有研究表明，DNA 甲基化并不参与LPS 诱导人肠上皮细胞IL-8 的表达，而是由组蛋白乙酰化调控[1]；亦或是组蛋白和DNA甲基化相互作用共同调节LPS 诱导人单核细胞TNF-α 的表达[16]。

结论：本研究结果表明，DNA 甲基化参与LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞TNF-α 表达上调。