彭国瑞， 彭小兵， 李旭妮， 董令赢， 蒋玉文

(中国兽医药品监察所， 北京 海淀 100081)

腐败梭菌(Clostridium septium)是一种革兰阳性厌氧杆菌，可引起多种动物的恶性水肿、肌肉坏死、气性坏疽以及坏死性肠炎等疾病。 该菌能够产生α、β、γ 和δ 4 种外毒素，其中α 毒素是其主要的致死性毒力因子，具有细胞毒性、坏死、溶血和致死性等特性。 对α 毒素结构与功能[1]、致病机制[2-4]以及作为类毒素疫苗[5]的应用等方面一直是国外学者研究热点。 本试验通过大肠杆菌表达重组α 毒素，对产物的生物活性进行研究，以期为α 毒素的结构功能、免疫原性、基因突变和疫苗研究提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和细胞 E.coli BL21(DE3)，购自北京康为生物有限公司；腐败梭菌C55-1 株(CVCC60021)、pET-32a( +)载体、Vero 细胞和绵羊红细胞均由本实验室保存。

1.2 血清与抗体 辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG，购自Sigma 公司；胎牛血清白蛋白(BSA)，购自Life Technologies 公司；腐败梭菌天然外毒素(小鼠致死毒力200 MLD/mL)、抗毒素(中和效价550 MLD/mL)由本实验室制备。

1.3 试剂 Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶EcoR I和SalⅠ等，均购自宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNA 连接酶，购自NEB 公司；酶标二抗显色试剂盒，购自Vector 公司；其他试剂均为国产或进口分析纯或试剂纯。

1.4 实验动物 体重16 ～18 g ICR 小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.5 α 毒素基因的扩增

1.5.1 引物设计 根据GenBank 中登录的腐败梭菌α 毒素序列(AY829447)，设计一对引物，用于扩增α 毒素的完整基因csa。 上游引物：5′-CCGATGTCAAAAAAATCTTTTGCT-3′，下 游 引 物：5′-GGCTA ATTAATATCAATTTTTTTA- 3′，分别引入EcoR I 和SalⅠ酶切位点识别序列(下划线部分)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5.2 PCR 扩增 25 μL 反应体系：10 ×PCR 缓冲液2.5 μL，dNTP 2.0 μL，20 pmol/μL 上下游引物各0.5 μL，腐败梭菌C55-1 株基因组模板1.0 μL，5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.5 μL，ddH2O 18 μL。 反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃1 min，50 ℃1 min，72 ℃1.5 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min。

1.6 pET32a-csa 的构建与鉴定EcoR I、SalⅠ双酶切α 毒素基因PCR 回收产物和pET32a( +)载体，片段回收后，16 ℃连接过夜，转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于Amp + LB 平板。 挑取生长良好的菌落PCR 和双酶切鉴定；同时送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，获得的序列与GenBank 中登录的序列进行同源性比对。

1.7 腐败梭菌α 毒素基因的表达

1.7.1 重组E. coli BL21(pET32a-csa)的诱导表达将鉴定合格的E. coli BL21 (pET32a-csa)接种Amp+LB 肉汤，37 ℃200 r/min 震荡培养到菌液OD600值至0.80 ～1.00，加IPTG 至终浓度1.0 mmol/L诱导4 h，以同样的方法诱导E.coli BL21 (pET32a)。

1.7.2 重组α 毒素表达形式的确定 离心收集复溶诱导后的重组菌，冰浴超声波破碎菌，功率100 w，每次4 s，间隔5 s，共20 次。 超声裂解后12 000 r/min(4 ℃)离心1 mim，收集上清和沉淀。

1.8 重组α 毒素的生物学特性鉴定

1.8.1 Western-Blot 分析 诱导后的重组菌SDSPAGE 结束后电转印PVDF 膜，以腐败梭菌抗毒素作为一抗，HRP 标记的兔抗羊IgG 为二抗检测。

1.8.2 溶血性试验 1.0%绵羊红细胞悬液中分别加入PBS 和蒸馏水作为阴阳性对照，其他依次加入重组菌菌液离心上清、超声波破碎沉淀、超声波破碎上清、天然毒素、厌气肉肝汤、LB 肉汤轻轻混匀，立即置37 ℃温育，观察并记录各管的溶血情况。 开始每隔15 min 观察1 次，1 h 后，每隔1 h 观察1 次，观察3 h。

1.8.3 细胞毒性试验 浓度为0.8 ×105～1.5 ×105Vero 细胞悬浮液，培养至形成单层细胞[6]，吸弃细胞生长液，加入诱导后经过滤除菌E.coli BL21(pET32acsa)的超声波破碎上清和天然毒素稀释液，37 ℃5%二氧化碳培养箱中孵育5 d，观察细胞病变。

1.8.4 小鼠致死毒性试验 诱导后E. coli BL21(pET32a-csa) 菌液0.20 mL/只，腹腔注射小鼠2只，重组菌菌液离心上清、超声波破碎上清、超声波破碎沉淀悬浮液以及天然毒素0.20 mL/只，尾静脉注射小鼠各2 只。 同时设E. coli BL21(pET32a)对照、PBS 和LB 培养基对照，观察72 h。

1.8.5 毒力测定 用明胶缓冲液将诱导后的E. coli BL21(pET32a-csa)菌液离心上清、超声波破碎沉淀以及超声波破碎上清进行梯度稀释，每个梯度0.20 mL/只，尾静脉注射小鼠各2 只，观察72 h。

1.8.6 血清中和试验 诱导后E.coli BL21(pET32acsa)的菌液离心上清、超声波破碎上清、超声波破碎沉淀和天然毒素用明胶缓冲液稀释至15 MLD/mL，取0.60 mL 分别加入0.30 mL 腐败梭菌抗毒素血清混合，37 ℃作用40 min，0.30 mL/只，尾静脉注射小鼠各2 只，对照组0.2 mL/只，尾静脉注射，观察72 h。

2 结果

2.1 α 毒素基因的扩增 以腐败梭菌C55-1 株基因组为模板，PCR 扩增出大小约1 300 bp 片段与预期大小相符。

2.2 重组表达载体pET32a-csa 的鉴定 重组质粒pET32a-csa 经PCR 和双酶切鉴定，均得到大小约1 300 bp 的片段。 测序结果表明，插入片段与预期设计吻合，阅读框完整正确，长度为1 323 bp，序列与GenBank 已公布的腐败梭菌α 毒素基因序列AY829447 相似度达到100%。

2.3 重组α 毒素的诱导表达 图1 所示，在大小约67 kDa 处见特异蛋白条带，与预期重组α 毒素分子量相符，表明E. coli BL21 (pET32a-csa) 诱导表达出重组α 毒素，包涵体形式为主，少部分以可溶形式表达。

2.4 重组α 毒素的生物学特性鉴定

2.4.1 Western-Blot 检测 图1 所示，表达产物能够与腐败梭菌抗毒素血清反应，说明经重组α 毒素具有反应原性。

2.4.2 溶血试验 表1 所示，加入天然毒素后红细胞立即发生完全溶血，各类型重组α 毒素均没有发生溶血。

2.4.3 细胞毒性试验 加入E. coli BL21(pET32a)超声波破碎上清、LB 肉汤、厌气肉肝汤和PBS 对照组的细胞生长良好；随着试验组超声波破碎上清和天然毒素的梯度稀释，细胞的病变程度随之减弱；当两种毒素稀释至104时，细胞几乎不会发生病变，表明重组α 毒素具有细胞毒性。

2.4.4 小鼠致死毒性试验 如表2，注射了诱导后的重组E. coli BL21 (pET32a-csa)菌液、菌液离心上清、超声波破碎上清和超声波破碎沉淀以及天然毒素的小鼠均在24 h 内死亡，其中天然毒素和超声波破碎上清小鼠给药1 h 内即发生死亡，而且所有死亡小鼠均表现出与注射天然毒素后相同的失明、后肢麻痹等中毒症状。 注射E. coli BL21(pET32a)各形式以及PBS 和LB 对照组的小鼠均健活。

表1 不同形式α 毒素的溶血的试验结果

表2 不同形式的重组α 毒素的毒性

表3 重组α 毒素的血清中和试验结果

2.4.5 毒力测定 超声波破碎上清毒力最强为300 MLD/mL，菌液离心上清和超声波破碎沉淀毒力相对较弱，见表2。

2.4.6 毒性中和试验 如表3 所示，用腐败梭菌抗毒素中和天然毒素和重组α 毒素注射小鼠，小鼠均存活，注射了没有进行中和反应的各形式毒素小鼠均发生了死亡，证明重组α 毒素的毒性可以被腐败梭菌抗毒素中和。

3 分析与讨论

Imagawa T 等用pUC19 载体通过大肠杆菌表达的腐败梭菌α 毒素，除具有小鼠致死毒性外，对于人红细胞还具有极强的溶血活性[7]，本试验证实了重组α 毒素具有细胞毒性和小鼠致死毒性但没有检测到对绵羊红细胞的溶血活性，并进一步测定了毒力，验证了其与抗毒素血清的相互作用。 结果表明，重组α 毒素具备类似于天然毒素的生物活性。分析原因，一方面重组α 毒素在结构上能够保持天然毒素的受体结合位点、功能活性位点和抗原表位；另一方面，根据天然毒素前体需要胰蛋白酶的裂解活化的特点[8]，推知宿主菌大肠杆菌产生了胰蛋白酶类对表达产物起到了活化作用。 此外，不同形式的重组毒素毒力存在的差异，说明可溶表达形式的重组α 毒素能够形成更加有利于功能发挥的空间构象。

在应用研究方面，α 毒素可以用于与疾病相关糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的结合[9]、血红蛋白尿的诊断[10]以及预防腐败梭菌的疫苗。 特别是在疫苗的应用研究方面，将腐败梭菌外毒素制成类毒素疫苗在美国已有广泛的应用，彭小兵[11]等研究表明，外毒素毒力在一定范围内与类毒素疫苗的免疫效果成正相关，而我国制造灭活菌苗常采用胰酶消化汤培养腐败梭菌，产生外毒素毒力有限，一般是100 ～200 MLD/mL[12]。 许多研究表明，用纯化后的α 毒素具有很好的免疫原性，能够使免疫机体抵抗不同血清型的腐败梭菌及其孢子的攻击[5、13]。 因此，获得毒力更强的α 毒素制成类毒素疫苗成为进一步提高腐败梭菌疫苗免疫效果的有效途径。 生物工程技术生产疫苗具有工艺简单、价格低廉、安全性高、易于规模化发酵等优点。 张燕[14]等以小鼠为实验动物模型证明了重组α 毒素具有免疫原性，Lancto C A[15]等用无细胞毒性的重组α 毒素免疫火鸡获得了对腐败梭菌的抵抗力。本试验制备的重组毒素含量高、毒力较强可达到300 MLD/mL。 由此可见，将重组α 毒素制成基因工程疫苗用于腐败梭菌病的免疫预防。 综上，利用原核表达系统可以制备出具有生物活性的重组腐败梭菌α 毒素，为有关α 毒素的结构功能、致病机制以及在生物技术等方面的应用研究提供了试验基础。