傅秋玲， 傅光华， 万春和， 韦启鹏， 陈红梅， 黄江南， 程龙飞，施少华， 刘荣昌， 陈翠腾， 李海琴， 黄 瑜

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所， 福建 福州 350013 ；2.江西省农业科学院畜牧兽医研究所， 江西 南昌 330200)

鹅细小病毒病，又称小鹅瘟，是由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起的1 月龄内雏鹅或雏鸭出现急性肠炎、呼吸困难、脚软为主要症状，其发病率和死亡率高均可达100%，是严重危害水禽养殖业的重要疫病之一[1]。 该病于1956 年在我国首次报道至2014 年，该病的易感动物和临床症状等均未发生明显的变化。 然而，在2015 年后，其感染谱扩增至樱桃谷鸭、半番鸭和麻鸭等，且临床症状也发生了明显的变化[2-3]。 该病毒能通过鹅胚、番鸭胚和半番鸭胚垂直传播[4-6]，在其他品种水禽胚中未见报道。 本研究在开展鸭胚垂直传播病原的检测中，发现江西红毛鸭胚中存在GPV 的感染，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 死亡的红毛鸭胚采集于江西吉安某红毛鸭孵化场；经检测无GPV 母源抗体的10日龄番鸭胚，购自福建省温氏有限公司；GPV 的阳性血清和胶体金试纸条由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病室研制并保存；EasyPure Viral DNA/RNA 抽提试剂盒(QIAGEN 公司生产)；Fast Pfu DNA 聚合酶和pEASY-Blunt 载体，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 病毒的分离 无菌采集死亡的红毛鸭胚尿囊液和胚体，胚体按样品∶PBS=1∶3 的比例，加入无菌PBS 缓冲液(pH 值7.2)进行匀浆，样品冻融3 次后，于4 ℃下经8 000 r/min 离心10 min 后，取尿囊液和胚体匀浆上清混合液经0.22 μm 滤器抽滤后经尿囊腔接种5 枚无母源抗体的10 日龄番鸭胚，每枚0.2 mL，37 ℃孵育，每日观察2 次，无菌收集3 ～7 d死亡的番鸭胚胚液，经无菌检验后，以10 日龄番鸭胚继续传3 代，无菌收集含毒胚液，保存于-80 ℃。

1.3 病毒的鉴定

1.3.1 胶体金试纸条检测 参照文献[6]具体步骤进行胶体金试纸条检测试验。 结果判定标准：质控线没有变红色，说明试纸条不能用；质控线变红色，检测线变红色，判为阳性结果；质控线变红色，检测线没有变红，判为阴性结果。

1.3.2 鸭胚中和试验 按固定血清稀释病毒法[7]进行鸭胚中和实验。 将上述含病毒的尿囊液进行十倍梯度稀释，依次取10-1-10-6的稀释度均分2份，1 份与等体积小鹅瘟病毒阳性血清混合，另1 份作为对照与正常血清等量混合，均放置37 ℃作用1 h后，每个稀释度的病毒血清混合液按每枚0.1 mL的剂量接种于5 枚10 日龄无母源抗体的番鸭胚，同时设病毒对照和血清对照组，置37 ℃温箱观察培养10 d，每天观察记录死亡情况，并按Reed-Muench 法计算病毒中和组的ELD50、病毒对照组的ELD50及其中和指数。

1.4 NS 基因的克隆分析

1.4.1 引物设计 参照GenBank 中GPV NS 基因，利用DNAStar 设计PCR 引物，引物F、R 分别对应于GPV 基因组序列的537 ～558 位和2 395 ～2 420 位核苷酸，产物长度为1 884 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 引物序列分别为上游引物F：5′-ATG GCA CTT TCT AGG CCT CTT-3′和下游引物R：5′-TTA TTG TTC ATT TTC AGC ATC ATC A-3′。

1.4.2 基因片段的克隆 按照EasyPure Viral DNA/RNA 抽提试剂盒说明书，提取收集的尿囊液的DNA，以此作为PCR 模板进行PCR 反应，50 μL PCR 反应体系为：5 ×Buffer 10 μL，dNTP (10 mmol/L) 1 μL，Fast Pfu DNA polymerase(5U/μL) 0.5 μL，上游和下游引物(20 pmol. L-1)各1 μL，模板2 μL，用ddH2O补充体积为50 μL，分别参照[6]PCR 反应条件进行目的产物的扩增。

1.4.3 PCR 产物测定分析 上述PCR 产物将扩增产物经琼脂凝胶纯化回收后，将目的片段克隆进平端克隆载体pEASY-Blunt，每个片段筛选3 个阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。 测序结果经DNAStar 等生物学软件分析序列同源性及分子特征；用MEGA4.0 软件以Neighborjoining 方法分析目的基因与GenBank 已发布的病毒序列的分子遗传进化关系，绘制出其进化树。

2 结果

2.1 病毒分离及GPV 胶体金检测 利用检测GPV的胶体金试纸条对收集的尿囊液进行病原检测，结果显示，C 线(质控线)上都出现条带，说明结果有效，且T 线(检测线)出现条带，表明含毒尿囊液中检测到鹅细小病毒阳性(图1)。

图1 胶体金试纸条检测结果

2.2 鸭胚中和试验 按固定血清稀释病毒法，运用Reed-Muench 法计算病毒中和组的ELD50为10-2.36/0.1 mL，病毒对照组的ELD50为10-4.66/0.1 mL，计算血清的中和指数为102.3(102.3=199.5)，中和指数表明，所分离病毒能被鹅细小病毒阳性血清特异性中和。

2.3 NS 基因序列分析结果 本试验以扩增鹅细小病毒NS 基因全长的引物从JX -JA -2017 分离株核酸中扩增出目的条带(见图2)，其大小均与预期扩增产物大小相符(1 884 bp)。 测序结果利用生物软件进行分子特征、同源性及分子遗传进化分析。 结果表明，本研究成功获得了病毒JX -JA-2017 分离株的非结构蛋白基因NS，大小为1 884 bp。 该毒株NS 基因与GenBank 中从家禽中分离的鹅细小病毒的核苷酸序同源性在93.8% ～99.6%之间，氨基酸序列同源性在96.8% ～99.7%之间，其中与YZ 株核苷酸和氨基酸的同源性最高，分别99.6%、99.7%， 与SH 株的核苷酸最低(94.3%)，与重组株M15 的氨基酸同源性最低(96.8%)(见表1)。

表1 序列同源性

基于NS 基因的遗传进化关系分析表明，JX -JA-2017 株病毒与鹅细小病毒分离株(YZ 株)同处于一个进化谱系，该进化谱系与Y，E 和YZ 等毒株同处于亚洲细小病毒分支中(见图3)。

图2 病毒NS 基因的扩增

图3 小鹅瘟NS 基因序列遗传进化树

4 讨论

近年来，鹅细小病毒的感染谱由原来的雏鹅(番鸭)扩大至樱桃谷鸭、半番鸭、绿头鸭、白改鸭以及褐莱鸭，且典型的临床症状也发生了改变[2-3]。同时早期的GPV 只在番鸭胚、鹅胚中进行垂直传播，我们于2015 年在半番鸭胚和刚孵化的1 日龄雏半番鸭分离鉴定出经典的GPV[6]，本研究从红毛鸭胚检测GPV 呈阳性，揭示GPV 的感染宿主在扩大，丰富了GPV 的流行病学内涵，为加强我国鹅细小病毒病的防控提供科学依据。

鹅细小病毒属于细小病毒科(Parvovirus)，细小病毒属(Parvovirus)的无囊膜单链DNA 病毒[8]。 该病毒全基因组大小为5 016 nt，其基因组主要由两个开放阅读框组成，其中包括2 种非结构蛋白(NS 和NS2)和3 种结构蛋白(VP1、VP2 和VP3)[8-9]。 目前，关于GPV 基因组研究主要集中于其结构蛋白，而对非结构蛋白的研究甚少[10]。 本研究将JX -JA -2017 株NS 基因核苷酸及编码的氨基酸与GenBank中有代表性的13 株GPV NS 序列进行了比对，核苷酸和氨基酸的同源性分别为94% ～99.6% 和94.8% ～99.5%，丰富了GPV 的分子生态学内涵。比对结果表明，该毒株的NS 核苷酸和氨基酸均较保守，这保证了GPV 在遗传进化中的稳定性，同时也提示该蛋白对于GPV 的功能方面起重要作用。研究发现，细小病毒的NS 蛋白在病毒DNA 复制与病毒基因、细胞基因表达调控方面起关键作用[10-11]。 同时，与GPV 同一属的细小病毒(如人细小病毒、阿留申水貂病毒和犬细小病毒)的NS 蛋白是该病毒诱导宿主细胞凋亡的关键因素[12-14]。 到目前为止，尚未见关于GPV NS 基因与细胞凋亡的相关研究；因此，有必要深入研究GPV NS 基因与宿主之间的相互关系，这为进一步阐明GPV 的致病机制提供理论依据，亦为该病的防控奠定基础。