包福祥 阿米娜 芦婷 赵鑫鑫 钱英红 杜雅楠*

1.内蒙古农业大学兽医学院

2.农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室

3.内蒙古自治区农牧业科学院

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)为负链RNA病毒，属于副黏病毒科麻疹病毒属，可引起犬科、鼬科和浣熊科动物的急性、高度接触性、致死性疾病，该病的主要传染源为患病动物和隐性感染的带毒动物。目前，犬瘟热常年发生，呈散发、地方流行，传染性强、发病率和死亡率高，是养犬业、经济动物养殖和野生动物危害最大的疾病之一。CDV由15616个核苷酸组成，编码基因按3’～5’端排序依次为：3’端前导序列、核衣壳蛋白基因（N）、磷蛋白基因（P）、基质蛋白基因（M）、融合蛋白基因（F）、血凝素蛋白基因（H）、聚合酶蛋白基因（L）和5’端引导序列。研究表明，CDV的N、F和H三种蛋白在病毒感染和宿主免疫方面起主要作用。因此，H、F和N蛋白的克隆和表达将对CDV的诊断和治疗具有非常重要的意义。

一、材料和方法

1.材料

（1）主要试剂。英特威犬四联疫苗（宠必威）由内蒙古农业大学教学兽医院刘俊平教授提供；Trizol试剂为Invitrogen产品；反转录试剂盒购自Promega公司；T4连接酶为NEB公司产品；Ex-Taq DNA聚合酶、凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、DL2000、DL5000 Maker、pMD19-T（Simple）Vector、EcoRI、XhoI、BamHI限制性内切酶均购自Takara公司；大肠杆菌Trans-T1感受态、Transetta (DE3)感受态购自北京全式金公司；Ni-NTA Sefinose(TM) Resin购自生工生物工程(上海)股份有限公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒购自碧云天公司。

（2）PCR引物。根据GenBank中发表的CDV Onderstepoort毒株基因序列，用Primer premier 5软件设计了三对特异性引物H1/H2、N1/N2、F1/F2，引物序列如表1所示，并在PCR产物上、下游分别引入酶切位点，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 CDV H、F和N蛋白基因特异性引物

2.试验方法

（1）CDV H、F、N基 因 的PCR扩 增。 利 用Trizol试剂法从英特威犬四联疫苗中提取CDV总RNA，并以总RNA为模板，用oligo (dT)12-18为引物，反转录合成cDNA，再以合成的cDNA为模板，H1/H2、N1/N2、F1/F2为引物进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。将CDV H、F、N基因PCR产物回收后与pMD19-T Simple Vector连接，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞。

（2）CDV H、F、N蛋白表达载体的构建。将pMD19T-H，pMD19T-N，pMD19T-F重组质粒和pET-28a载体分别用XhoI/ BamHI 和XhoI /EcoRI进行酶切，酶切产物经1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并将得到的H、F、N片段和pET-28a载体进行切胶回收，再利用T4连接酶将回收的片段和载体连接，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，涂布含有Kana+抗性的LB固体培养基，过夜培养，提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定。

（3）CDV H、F、N蛋白的诱导表达和纯化。将鉴定正确的CDV H、F、N表达质粒转化大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞，涂布含有Kana+抗性的LB固体培养基，37℃过夜培养，挑取单克隆菌落至3 ml 含有Kana+抗性的LB培养基中，37℃ 200 rpm过夜培养。取1 ml的菌液接种到100 ml含有Kana+抗性的LB液体培养基中，37℃ 200 rpm培养2 h，菌液OD600值达到0.4～0.6，加入终浓度1 mM的IPTG诱导5～8 h，4000 rpm离心10 min收集细菌，用PBS缓冲液洗涤两次后用超声破碎仪进行细胞破碎，4℃1000 rpm离心10 min，分别收集破碎上清和沉淀，将沉淀用PBS溶液洗2次后加入3 ml带有8 M尿素的Binding Buffer进行溶解。将1 ml Ni-NTA resin放入15 ml 离心管中，加入3 ml Binding Buffer洗涤两次，然后将蛋白加入平衡好的Ni-NTA resin中，在冰上静止结合2 h，4℃ 5000 rpm离心5 min，收集上清，标记为穿透液（FL），在Ni-NTA resin中加入2 ml Binding Buffer洗涤2次，洗涤液标记为W，最后加入2 ml含有150 mM咪唑的Elution Buffer洗涤2次，标记为E。将表达和纯化产物进行SDS-PAGE凝胶电泳检测。

二、结果

1.CDV H、F、N基因的PCR扩增

以H、F、N基因特异性引物进行PCR扩增，产物经电泳检测，如图1所示，分别得到H基因990 bp、F基因939 bp和N基因1080 bp的片段，与预期目的片段大小相符。

2.CDV H、F、N蛋白重组表达质粒构建与鉴定

将CDV H、F、N基因连接pET-28a载体构建表达质粒，以重组表达质粒为模板，以H1/H2、N1/N2、F1/F2为引物，进行PCR扩增鉴定，如图2所示，得到与预期大小相符的片段。

图1 CDV H、F、N基因PCR扩增产物电泳结果

图2 CDV H、F、N蛋白重组表达质粒PCR鉴定结果

图3 重组表达质粒酶切鉴定结果

将重组质粒以XhoI/BamHI 和XhoI/EcoRI进行酶切，结果如图3所示，可以得到大小为5000 bp左右的pET-28a载体和1000 bp左右的CDV H、F、N基因片段，证明目的片段已正确插入pET-28a载体。

3. CDV H、F、N蛋白诱导表达和纯化产物SDSPAGE鉴定

将重组质粒转化入大肠杆菌Transetta（DE3）感受态细胞中，经IPTG诱导，重组蛋白主要以包涵体的形式表达，诱导表达和经亲和纯化后的蛋白进行SDSPAGE分析，结果如图4所示，显示在相对分子量约37 KDa处有目的蛋白表达条带，与预测的重组蛋白分子量相符。

图4 重组蛋白SDS-PAGE鉴定结果

三、讨论

犬瘟热是目前危害犬科动物、经济动物和野生动物的主要疫病之一。研究发现，CDV的H、F和N蛋白在病毒感染和机体免疫过程中具有非常重要的作用。CDV H蛋白由19441946个核苷酸构成，能够诱导机体产生中和抗体，对CDV宿主的特异性起决定作用，是CDV重要的免疫原。H蛋白可通过结合到细胞表面的受体上而将CDV吸附到宿主细胞上，与F蛋白共同介导病毒与宿主细胞间发生膜融合，进入宿主细胞。F蛋白由2205个核苷酸组成，可以分为三个功能区：附着区、融合区和穿膜区，其中能对蛋白或整个病毒生物学特性造成影响的位于病毒粒子外侧的附着区和融合区是病毒感染细胞并在宿主体内扩散所必需的重要成分。N蛋白是CDV含量最多的蛋白，由1683个核苷酸组成。N蛋白包括三个区域：N末端可变区、C末端可变区和中间的高度保守区，中间的保守区在N蛋白的结构和功能中起主要作用。N蛋白因为其较强的保守性，可以在感染初期就产生免疫应答反应，同时引起抗体反应。因此，在患病的初期诊断和治疗中，N蛋白有较为重要的影响。本研究所表达和纯化的CDV H、F和N蛋白为CDV的诊断方法和治疗性抗体的开发奠定了坚实的基础。