万　蒞，王　莉

(1.湖北省妇幼保健院药剂科，湖北 武汉　430070；2.武汉科技大学附属天佑医院口腔科，湖北 武汉　430064)

*副主任药师。研究方向：医院药学。E-mail：1027949621@qq.com

#通信作者：主管医师。研究方向：合理用药。E-mail：1220014244@qq.com

冬凌草甲素是从唇形科香茶菜属植物冬凌草中提取的二萜化合物，能增强机体免疫功能，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗突变等作用，临床上用于抗肿瘤、抗菌消炎和降压治疗[1]，但其在水、油中的溶解度均较小[2]，且味道极苦，临床应用受到了限制。而利用新型包合材料羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)作为难溶性药物的载体，将药物分子包合或嵌入HP-β-CD的筒状结构内形成超微粒分散物，不仅可以提高难溶性药物的水溶性和生物利用度，还可掩盖药物的不良气味[3]。本研究旨在探讨冬凌草甲素包合物口腔崩解片的制备工艺和质量。

1　材料

1.1　仪器

SPD-20 A型液相色谱仪(LC-20AT，日本岛津公司)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；真空干燥箱(上海特成机械设备有限公司)；差式扫描量热仪(德国NETZSCH公司)；片剂硬度测试仪(天津市国铭医药设备有限公司)；智能溶出度测定仪(天津大学无线电厂)；超声波清洗器(江苏昆山超声仪器厂)；恒温磁力搅拌器(山东青岛机械设备有限公司)；单冲压片机(江苏泰兴制药机械工厂)。

1.2　药品与试剂

冬凌草甲素(河南济世药业有限公司，纯度99.5%)；冬凌草甲素标准品(中国药品生物制品检定所，纯度98.5%)；冬凌草甲素包合物崩解片(自制，批号：20161212、20161213)；冬凌草甲素片(河南济世药业有限公司，规格：50 mg/片，批准文号：国药准字Z41020014，批号：20140501)；HP-β-CD(西安德立生物化工有限公司)；微晶纤维素(MCC，上海昌为辅料公司)；羧甲基淀粉钠(CMS-Na，美国ISP公司)；甘露醇(河北华旭药业有限公司)；硬脂酸镁(浙江湖州展望化学药业有限公司)，所有试药均为药用级。

2　方法与结果

2.1　含量测定

参考相关文献[4-5]，测定冬凌草甲素的含量。

2.1.1色谱条件：色谱柱为Diamonsil Cl8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(V∶V=60 ∶40)的混合溶液，流速为1 ml/min，柱温为30 ℃，进样量为10 μl，紫外检测器波长为240 nm。

2.1.2溶液的制备：(1)对照品溶液：精密称取适量冬凌草甲素对照品，加甲醇使之溶解，制成浓度为400 μg/ml的标准品储备液。精密量取标准品储备液2 ml置于10 ml容量瓶中，加流动相至刻度，制成80 μg/ml的冬凌草甲素对照品溶液。(2)供试品溶液：取自制的包合物口腔崩解片10片研细，精密称取适量(约相当于冬凌草甲素40 mg)，置于100 ml容量瓶中，加甲醇20 ml，超声处理10 min使冬凌草甲素溶解，加入流动相定容，再对溶液进行超声处理后滤过，精密量取续滤液10 ml，用流动相定容于50 ml容量瓶中，揺匀备用。(3)空白溶液的制备：制备出不含冬凌草甲素的包合物口腔崩解片，再按供试品溶液的制备方法制备。

2.1.3系统适应性试验：取对照品溶液、供试品溶液和空白溶液各10 μl，进样分析，冬凌草甲素的保留时间约为10.7 min，空白溶液无色谱峰，对冬凌草甲素无干扰，结果见图1。

A.空白溶液；B.对照品溶液；C.供试品溶液；1.冬凌草甲素 A.blank solution; B. reference solution; C. sample solution；1 oridonin 图1　高效液相色谱图Fig 1　HPLC chromatogram

2.1.4线性关系考察：分别精密量取标准品储备液0.05、0.10、0.20、0.40、1.00、2.00和5.00 ml，置于10 ml容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，得到质量浓度为2、4、8、16、40、80和200 μg/ml的系列溶液，分别吸取10 μl，进样测定，记录峰面积。以冬凌草甲素质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归，回归方程为Y=15.185X+28.701(r=0.999 5)。结果表明，冬凌草甲素在2.00～200.00 μg/ml范围内线性关系良好。

2.1.5精密度试验：取浓度为4、16和80 μg/ml的对照品溶液，l日内测定5次，计算日内精密度；每日测定1次，连续测定5日，计算日间精密度，结果日内和日间RSD均<1.5%，表明仪器的精密度良好。

2.1.6稳定性试验：取“2.1.2”项下供试品溶液放置0、1、2、3、4、8、12及24 h时进样测定。结果显示RSD为0.75%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内是稳定的。

2.1.7重复性试验：分别精密称取同一批样品6份，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进行重复性试验。结果显示，RSD为1.14%(n=6)，表明重复性较好。

2.1.8加样回收率试验：分别精密吸取“2.1.2”项下供试品溶液3份，加入空白溶液0.5 ml中制得4、16及80 μg/ml的低、中及高3个质量浓度的溶液，每个质量浓度平行3份，按照“2.1.1”项下方法进样测定，并根据标准曲线得到实测浓度，计算加样回收率，加样回收率=(C测得/C加入)×100%。结果显示，低、中及高浓度的加样回收率分别为101.3%、97.8%及98.7%，RSD分别为1.22%、1.56%及1.37%，符合要求。

2.2　包合物的制备与鉴定

2.2.1包合物的制备：参考相关文献[6]，称取HP-β-CD 1 562.1 mg溶于蒸馏水50 ml中，加入含冬凌草甲素55 mg的甲醇溶液混合均匀，于60 ℃下用恒温磁力搅拌器搅拌,反应4 h后置入冰箱冷藏室，5 ℃下放置2 d，使沉淀完全，抽滤，所得沉淀物用蒸馏水及甲醇冲洗，所得白色固体干燥后研细并过80目筛，储存于干燥器内，即得冬凌草甲素HP-β-CD包合物。

2.2.2包合物的鉴定：分别取冬凌草甲素原料药、HP-β-CD、二者的物理混合物和冬凌草甲素HP-β-CD包合物进行差示扫描量热分析[7]。结果显示，冬凌草甲素在258.8 ℃有1个吸热峰，HP-β-CD曲线平直无明显吸热峰，物理混合物的曲线基本上是冬凌草甲素和HP-β-CD的叠加，包合物曲线中无吸热峰出现，说明包合物中已不存在冬凌草甲素的单体, 而是形成了一种新的物质，包合物已形成，见图2。

a.冬凌草甲素；b.HP-β-CD；c.物理混合物；d.包合物 a. oridonin；b. HP-β-CD; c. physical mixture; d. inclusion complexes 图2　差示扫描量热图谱Fig 2　Differential scanning calorimetry spectrum

2.2.3包封率和载药量的测定[8-9]：精密称取冬凌草甲素包合物(3批)各20 mg，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀后按“2.1”项下方法测定冬凌草甲素的含量，计算包合物的载药量和包封率。载药量(%)=包合物中药物质量/包合物总质量×100%。包封率(%)=包合物中药物质量/药物的总投入量×100%。结果表明，包封率和载药量分别为75.53%、37.03%(n=3)。

2.3　包合物口腔崩解片的制备工艺研究

2.3.1包合物口腔崩解片的处方筛选：崩解剂和填充剂是制备口腔崩解片的主要辅料，常用的有MCC、羟丙甲基纤维素、CMS-Na、甘露醇、淀粉、乙醇、乳糖和交联聚维酮等[10]。通过预试验，结合湿法压片的特点和药物性质，选用甘露醇为填充剂，CMS-Na+MCC为崩解剂，50%乙醇为黏合剂，进行单因素实验。以体外崩解时间和10 min体外溶出度为考察指标，采用正交设计法筛选3种辅料MCC(A)、CMC-Na(B)及甘露醇(C)的用量，按L9(34)设计正交表，见表1。正交试验结果表明，因素A对崩解片的崩解时间和溶出度影响最大，B次之，C最小，故选择最佳崩解条件是A2B3C3(见表2—3)，即MCC 90 mg，CMC-Na 48 mg，甘露醇25 mg，并添加适量的硬脂酸镁作润滑剂。冬凌草甲素包合物口腔崩解片(0.3 g/片)处方组成为：冬凌草甲素包合物135 mg(含冬凌草甲素50 mg)，MCC 90 mg，CMS-Na 48 mg，甘露醇25 mg，硬脂酸镁2 mg。

表1　因素与水平Tab 1　Factors and levels

表2　正交试验结果Tab 2　Design and results of orthogonal test

表3　方差分析结果Tab 3　Results of variance analysis

2.3.2包合物口腔崩解片的制备：将过80目筛的70%崩解剂(MCC、CMS-Na)与处方量的冬凌草甲素包合物混合均匀，用50%乙醇溶液制湿颗粒，过20目筛，40 ℃干燥2 h，过18目筛整粒，加入甘露醇、剩余崩解剂和硬脂酸镁混匀，压片，即得包合物口腔崩解片。每片质量0.3 g，含冬凌草甲素50 mg。

2.3.3验证实验：依照处方工艺制备5批冬凌草甲素包合物口腔崩解片，对筛选的处方进行验证实验。结果显示，5批自制包合物崩解片各项验证指标均符合要求，志愿者口感良好，口服无苦味，筛选出的处方及工艺是稳定可行的，见表4。

表4　验证试验结果(n=5)Tab 4　Results of validation test (n=5)

2.3.4主药的含量测定：取3批自制的包合物口腔崩解片，按照“2.1”项下方法测定主药含量。结果显示，冬凌草甲素平均含量分别为标示量的97.91%、99.22%及98.86%(n=3)。

2.4　溶出度的测定

按转篮法测定和比较包合物崩解片和普通片剂的溶出度[11]。测定条件：转速100 r/min，温度(37±0.5)℃, 溶出介质蒸馏水500 ml，取包合物崩解片和普通片各6片进行测定，取样时间为5、10、15、20、30和60 s，2、3、4、5、6、7和8 min，取样5 ml，并在30 s内补液5 ml，取得的样品用0.45 μm滤膜滤过，测定两种片剂中冬凌草甲素的百分含量，计算两种片剂的累积溶出度。结果显示，根据溶出度曲线图，冬凌草甲素包合物口腔崩解片累积溶出度在2 min时达到了98.2%(RSD=1.7%，n=6)，明显高于普通片；普通片2 min时为21.1%(RSD=1.6%，n=6)，8 min时为50.6%(RSD=1.5%，n=6)，溶出度明显低于包合物口腔崩解片，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。表明包合物崩解片中冬凌草甲素的溶解性得到了明显增加，相同时间内包合物崩解片的累积溶出量显著高于市售普通片，包合物崩解片更易于在体内吸收、起效。

图3　冬凌草甲素包合物口腔崩解片与普通 片剂的溶出度曲线图(n=6)Fig 3　Dissolution curve of oridonin hydroxypropyl-β- cyclodextrin inclusion complexes Orally disintegrating tablets and common tablets(n=6)

3　讨论

HP-β-CD为环状低聚糖，具有内疏水、外亲水的结构，在水溶液中能与多种疏水化合物结合形成主/客体或超分子包合物，提高疏水化合物的水溶性[12]。制成HP-β-CD包合物后，不仅可以提高冬凌草甲素的溶解度，还可掩盖其苦味，降低其刺激性、毒性和副作用等[13]。

口腔崩解片是在口腔内不需水即能崩解或溶解的片剂，具有良好的临床应用前景。将冬凌草甲素包合物进一步制成口腔崩解片后，药物在到达胃肠道前就能迅速崩解并分散成细微的颗粒，使药物大面积分布，吸收点增多而胃肠道残留少，从而进一步减少其对胃黏膜的刺激性。

本研究分别采用沉淀法和正交试验法，将冬凌草甲素高度分散在HP-β-CD载体中，以MCC、CMS-Na和甘露醇为赋形剂制备了包合物口腔崩解片，提高了冬凌草甲素的溶解度和体外溶出度，制备工艺可行，质量可控，为冬凌草甲素新型药物载体研究提供了依据。

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