邱源旺　甘建和　杨文龙　戴亚萍　王俊　张波　汪铮　苏婷婷　李燚光　周红燕　徐微　黄利华

214005 无锡市第五人民医院(邱源旺、戴亚萍、王俊、张波、汪铮、李燚光、苏婷婷、周红燕、徐微、黄利华)；215006 苏州大学附属第一医院(甘建和)；330006南昌大学第二附属医院(杨文龙)

目前国内外慢性乙型肝炎防治指南均将恩替卡韦(entecavir, ETV)作为慢性乙型肝炎(CHB)患者临床抗病毒治疗的首选药物之一，但因其疗程的长期性，造成临床上部分患者服药的依从性差，自行停药以及不规范停药的现象时有发生。因此，如何实现ETV安全停药是目前研究的热点及难点问题。近期研究报道ETV除了直接抑制HBV复制外，通过调节Th1/Th2/Th17细胞因子水平对控制病毒及维持病毒学应答产生影响[1]，推测ETV停药后是否复发可能与Th1/Th2/Th17细胞因子表达水平相关，这些细胞因子的变化以及其在维持持久应答中的作用目前不清楚，仍待进一步阐明。

本研究旨在接受ETV治疗并达到我国2010年发布的慢性乙型肝炎防治指南停药标准、HBeAg阳性的CHB患者中，研究ETV停药后Th1/Th2/Th17细胞因子表达水平的动态变化特点及其在ETV停药后维持持久病毒学应答中的作用。

1　对象与方法

1.1研究对象入选2009年1月至2011年12月在无锡市第五人民医院、南昌大学第二附属医院、苏州大学附属第一医院门诊或住院的HBeAg阳性的CHB接受ETV治疗患者。

1.2入选标准(1)接受ETV治疗至少2年以上，并符合2010年我国发布的慢性乙型肝炎防治指南的停药标准[2]；(2)愿意签署医院伦理委员会通过的知情同意书，依从性好、资料完整、能接受随访的CHB患者。

1.3排除标准(1)接受ETV治疗前或停药时，经影像学、肝活检或Fibrotouch提示明显肝纤维化或肝硬化的患者；(2)既往出现过对任何一种核苷(酸)类似物耐药的患者；(3)既往有停药后复发史的患者；(4)合并丙型肝炎、自身免疫性或胆汁淤积性肝病、或伴有恶性肿瘤、严重全身性疾病；(5)孕妇；(6)近6月内使用过免疫调节剂的患者。

1.4停药标准[2]HBeAg 阳性患者在达到了HBV DNA检测下限以下(HBV DNA<100拷贝/ml)以及ALT复常和HBeAg血清学转换之后，再经过1年以上的巩固治疗仍保持不变，并且具有2年以上总疗程的患者。

1.5病毒学应答定义[3]病毒学应答是指经抗病毒治疗血清HBV DNA降至低于检测值下限。持续病毒学应答具体指的是停止抗病毒治疗后随访52周仍能保持血清HBV DNA持续低于检测值下限。

1.6复发(Relapse)定义[3]病毒学复发即获得病毒学应答的患者在停药之后，每隔1个月检测两次HBV DNA都超过104拷贝/ml。

1.7复发的处理对于病毒学复发的患者再次予以恩替卡韦抗病毒治疗，同时结束本停药研究的随访，纳入普通CHB的抗病毒随访中。

1.8观察指标和检测方法分别在停药0、12、24、52周检测肝功能、HBV DNA、HBV标志物(HBV-M)、Th1/Th2/Thl7细胞因子。肝功能采用日立7600全自动生化分析仪及配套试剂检测；HBV DNA及HBV基因分型由lightcycle基因荧光定量分析仪检测，HBV DNA检测采用PCR-荧光探针法，严格按照试剂盒说明书进行操作，检测下限为100拷贝/ml；HBV基因分型采用实时荧光PCR法，使用上海复星科技发展有限公司生产的试剂盒检测，严格按照试剂盒说明书进行操作；ETV相关耐药位点检测由美国贝克曼库尔特公司CEQ-8000基因测序仪采用HBV聚合酶区基因序列分析法检测，引物由上海

表1　复发组与持续病毒学应答组基线特征比较

生工生物工程公司合成。HBeAb、HBeAg采用1235时间分辨荧光免疫分析仪检测。HBsAg的定量检测采用i2000化学发光免疫分析仪及采用Abbott试剂检测；Th1/Th2/Th17细胞因子采用微量样本多重蛋白定量(CBA)法，使用美国BD公司生产的人Th1/Th2/Thl7细胞因子试剂盒检测单个样本中多种蛋白的含量，包括Th1(IL-2、IFN-γ、TNF-α)、Th2(IL-4、IL-6、IL-10)和Thl7(IL-17A)。停药观察时间均为52周。

1.9统计学方法计量资料以均数±标准差(mean±SD)或中位数±四分位间距(M±QR)表示，采用t检验、或秩和检验Mann-WhitneyU检验；组间率的比较用R x C表的χ2检验。HBV DNA在检测水平以下的患者按照2.0 log10拷贝/mL进行数据统计分析，复发患者将复发时的检测数据计入随后的各随访时间点的检测结果。所有数据采用SPSS16.0统计软件分析。所有统计分析基于双侧假设检验，以α=0.05为检验水准，P<0.05差异有统计学意义。

2　结果

2.1研究对象基本临床资料本研究根据停药标准入组停药患者共136例，HBV聚合酶区基因序列分析均未发现ETV耐药位点耐药，剔除肝硬化及随访<24周的患者各12例，纳入满足本研究方案的CHB患者112例，其中男74例，女38例，年龄22～63岁(40.1±11.2)，抗病毒治疗总疗程26～40个月，平均(30.7±3.5)个月；停药后52周病毒学复发率为48.2% (54/112)。根据患者停药52周是否发生病毒学复发，将患者分复发组(Viral relapse，VR)和持续病毒学应答组(Sustained off-treatment virological response,SVR)，SVR组患者年龄、基线HBV DNA水平均低于VR组，VR组经HBV聚合酶区基因序列分析均未发现恩替卡韦耐药位点耐药，2组间比较均有统计学意义(均P<0.001)，性别、基线ALT水平、基因型、病毒学应答时间及治疗疗程比较均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

2.2SVR组与VR组停药后HBsAg(log10IU/mL)、HBVDNA、HBeAg及ALT水平的变化SVR组与VR组停药后12周、24周、52周间HBsAg水平、HBV DNA水平、HBeAg水平及ALT水平比较均有统计学差异(均P<0.05)，见表2。

表2　VR组与SVR组停药后HBsAg、HBV DNA、HBeAg及ALT水平的变化

注：a与同组停药基线(0周)比较，P<0.05.

Note:aP<0.05 compared with the baseline of entecavir discontinuation of the same group.

2.3SVR组与VR组患者停药时Th1/Th2/Th17细胞因子表达水平比较SVR组和VR组患者在停药时血清Th1(IFN-γ、IL-2、TNF-α)水平比较，IFN-γ水平差异有统计学意义(P=0.004，表3)，IL-2、TNF-α水平差异无统计学意义(均P>0.05，表3)。SVR患者血清Th2(IL-4、IL-6、IL-10)水平均低于VR，组间比较只有IL-10水平结果差异有统计学意义(P=0.001，表3)。停药时Th17(IL-17A)SVR组高于VR组，但两组间结果比较差异无统计学意义(P=0.609，表3)。

表3　VR组与SVR组停药后Th1(IFN-γ、IL-2、TNF-α)/Th2(IL-4、IL-6、IL-10)/Th17(IL-17A)细胞因子表达水平(ng/ml)比较

注：a与同组停药基线(0周)比较，P<0.05.

Note:aP<0.05 compared with the baseline (0 week) of entecavir discontinuation of the same group.

2.4Th1/Th2/Th17细胞因子表达水平在ETV停药后维持病毒学应答中的作用SVR组停药后Th1型细胞因子中TNF-α、IL-2、IFN-γ水平出现波动，但无显著性差异(均P>0.05，表3)。Th2类细胞因子IL-10水平呈显著下降趋势，各随访时间点与停药基线结果比较差异均有统计学意义(t=2.092,2.368,2.726,均P<0.05，表3)。SVR组患者在各随访时间点IFN-γ水平保持在较高水平，均显著高于VR组(均P<0.05，表3)。

VR组患者停药后Th1细胞因子IFN-γ水平前24周呈下降趋势，24周后呈上升趋势，停药24周IFN-γ水平与停药基线结果比较差异有统计学意义(t=2.984,P<0.05，表3)，Th2类细胞因子中在随访52周过程中IL-4、IL-6及IL-10水平出现波动无显著性差异(均P>0.05，表3)。VR组患者在停药0、12、24、52周IL-10水平均显著高于SVR组患者(P<0.05，表3)。

SVR组患者停药后IL-17A水平略有升高，各随访时间点高于复发组，但组间结果比较差异均无统计学意义(均P>0.05, 表3)。

3　讨论

HBV感染的临床转归一般是由感染之后人体的免疫系统和病毒之间相互作用所决定。正常的免疫状态下，Th1/Th2两类细胞因子相互制约，处于动态平衡，对机体抵抗病原体感染、控制及清除病毒均具有重要意义，一旦这种动态平衡被打破将导致疾病的发生与发展，影响疾病的预后转归[4]。既往研究发现，在ETV抗病毒治疗中，第4周时患者血清IFN-γ水平显著低于基线水平，其后又缓慢上升，但在48周时仍低于基线点，因此认为应用ETV治疗后患者IFN-γ水平的下降一方面降低体内的炎症反应，减轻肝脏的纤维化反应，延缓疾病的进展；另一方面ETV治疗过程中体内Th1类免疫反应下降而Th2类免疫反应不足，机体清除病毒的能力被削弱而不利用病毒的清除与控制，当停止用药或出现耐药时仍会出现病毒学复发。也有研究报道ETV在抗病毒治疗过程中，可促进IFN-γ水平升高，使Th1/Th2细胞因子平衡的变化向Th1方向倾斜，从而发挥控制HBV复制、促进HBeAg的血清转换作用[5]。本研究结果显示ETV停药后SVR组在停药后52周Th1细胞因子虽然没有发现显著升高，但这些患者IFN-γ、IL-2、TNF-α水平均稳定在较高水平，而且IFN-γ水平在各随访时间点均显著高于VR组,说明Th1细胞因子IFN-γ水平在ETV停药后维持病毒学应答中发挥一定的作用。其机制可能是一方面停药后机体仍能通过自身的T细胞、自然杀伤细胞等分泌一定水平的IFN-γ，调节T淋巴细胞的增殖、分化，参与细胞免疫，从而抑制HBV DNA复制[6-7]；另一方面IFN-γ可以抑制Th2型细胞因子表达，使患者体内IL-10表达水平降低，Th1/Th2细胞因子平衡的变化趋势向Th1方向倾斜，患者体内细胞免疫功能得到了维持或加强，有利于控制病毒和减少停药后病毒学复发[8]。VR组患者停药后52周随访过程中Th2类细胞因子稳定在较高水平，Th1细胞因子中IFN-γ水平呈下降趋势，而且停药24周IFN-γ水平较停药基线水平显著下降。患者在停药24周后IFN-γ水平出现上升，可能原因为部分患者停药后出现HBV DNA反弹，诱发机体免疫反应，通过自然杀伤细胞或T细胞产生IFN-γ，进一步调节T淋巴细胞的分化、增殖，参与肝脏炎症反应及抗病毒[9]。VR组患者IL-10水平在停药后呈上升趋势，显著高于SVR组，说明Th2细胞因子IL-10水平的高表达可能与病毒学复发有关。其机制可能是IL-10能促使慢性HBV感染的T细胞耗竭，抑制病毒特异性T细胞免疫应答[10]，同时在抗原呈递细胞作用下,抑制T淋巴细胞等分泌细胞因子,下调IFN-γ等Th1型细胞因子的表达,使Th1/Th2细胞因子平衡的变化总趋势向Th2方向倾斜，HBV DNA不能被有效清除，从而导致CHB患者ETV停药后易复发[11-12]，但其确切机制尚需进一步深入研究。上述研究结果表明Th1/Th2细胞因子的平衡状态与ETV停药后复发密切相关。

近期研究发现Thl7参与肝脏炎症反应及清除病毒过程，与CHB的发生、发展密切相关[13]。Yu等[14]报道ETV抗病毒治疗过程中随着HBV DNA的水平下降，伴有Th17细胞数量升高。本研究结果显示，虽然ETV停药后各随访时间点SVR组IL-17A水平高于VR组，但结果比较均无显著性差异，提示Th17细胞因子IL-17A与ETV停药后复发无显著相关性。

综上所述，Th1细胞因子IFN-γ水平稳定在较高水平表达有利于ETV停药后维持病毒学应答，Th2细胞因子IL-10水平的高表达可能与病毒学复发有关，CHB患者ETV停药后可能通过Th1/Th2细胞因子平衡机制在维持持久的病毒学应答中发挥一定的作用。由于本研究入组病例数相对少，停药后观察时间短，对于长期ETV停药后复发与Th1/Th2/Th17细胞因子水平的关系有待扩大样本及长期观察研究。

利益冲突无

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