姜晓林　张晓梅　逄博　孙大鹏　王显军　丁淑军

250014 济南，山东省疾病预防控制中心病毒病预防控制所

发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是由我国发现的一种新型布尼亚病毒引起的疾病，以发热、乏力等全身反应和胃肠道症状为主并伴有白细胞和血小板减少[1]，由于该病病死率较高且早期临床特征不典型，因此选择使用适宜的实验室检测技术对于该病的诊断非常重要。2016年8月在匈牙利布达佩斯国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)将该病毒分类进行调整，目前该病毒属于Bunyavirales目，Phenuiviridae科，Phlebovirus属，命名为SFTSPhlebovirus，该病毒基因组为分节段单股负链RNA病毒，包含3个片段，L片段全长为6 368个核苷酸，包含单一读码框架，编码RNA依赖的RNA聚合酶；M片段全长为3 378个核苷酸，含有单一的读码框架，编码1 073个氨基酸的糖蛋白前体；S片段是一个双义RNA，基因组以双向的方式编码病毒核蛋白和非结构蛋白。目前已建立针对病毒基因组的实时荧光定量PCR检测技术[1-5]和检测病毒特异性总抗体、IgM抗体、IgG抗体的酶联免疫吸附实验[6-9]，但是不同检测方法的适用性以及人类感染后体内病毒血症及抗体动态变化特征的研究较少，本文通过比较各种检测技术对不同时期采集标本的检测结果，并观察病毒核酸、IgM抗体、IgG抗体的动态特征，为疾病的诊断方法选择提供理论依据。

1　材料与方法

1.1调查对象对各地市报告的SFTS疑似病例开展个案调查，并采集血清标本。对确诊病例跟踪随访，采集恢复期血清标本，详细记录标本的基本信息。疑似病例定义：具有流行病学史(近2周有户外工作、野外旅游或蜱虫接触史)且出现发热伴外周血血小板和/或白细胞降低等临床症状者。实验室诊断病例：满足疑似病例条件，且病毒核酸或抗体检测阳性者。血清标本保存于-80 ℃冰箱统一检测。

1.2实时荧光定量PCR检测采用三通道探针法检测疑似病例血清中病毒核酸，核酸提取采用RNeasy Mini Kit试剂盒(Qiagen，德国，Cat.no.74104)，操作按说明书进行，实时荧光定量PCR检测采用SuperScriptⅢ Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System试剂盒(Invitrogen，美国，Cat.no.11732)，反应条件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。引物探针由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所提供。阳性判定标准：3个信道中至少有两个信道的CT值< 35即为阳性。

1.3捕获法检测病毒IgM抗体(Mac-ELISA)用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液(PH9.6)稀释抗原(μ链抗体，Sigma，美国)浓度至2 μg/ml,每孔加入100 μl，4℃放置过夜，用PBST缓冲液(PH7.4磷酸盐缓冲液，0.5%吐温-20)洗板两次，用含1%BSA的PBST缓冲液，室温封闭2 h，晾干后真空封板4 ℃保存备用。包被板中加入100 μl样品稀释液(5%脱脂奶粉)，然后加入10 μl待测血清，每板设阴性对照、阳性对照、空白孔各两孔，37 ℃温育30 min，PBST洗涤5次，然后每孔加入100 μl核蛋白酶标试剂(1∶6000稀释，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所出血热室提供)，37 ℃温育30 min，洗涤5次，扣干，每孔加入酶底物和显色液各50 μl/孔，室温显色10 min，后加入2 mol/L硫酸终止液50 μl/孔。酶标仪450 nm波长测A值。阳性判定：样品A值≥临界值判定为阳性；阴性判定：样品A值<临界值判定为阴性；临界值=0.10+阴性对照孔的平均值(阴性对照孔A值不足0.02按0.02计算)。

1.4间接法检测病毒IgG抗体基本操作同IgM抗体检测，包被抗原采用重组核蛋白(NP，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所出血热室提供)，包被浓度为2 μg/ml，酶标抗体采用辣根过氧化氢酶标记的羊抗人IgG抗体(1∶2000稀释，Sigma，美国)，酶标仪450 nm波长测A值。阳性判定：样品A值≥临界值判定为阳性；阴性判定：样品A值<临界值判定为阴性；临界值=0.10+阴性对照孔的平均值(阴性对照孔A值不足0.04按0.04计算)。

1.5统计学方法按照发病到采样的时间间隔分组，比较不同检测方法对不同时间组采集标本的检测结果，分析检测结果与采样时间的关系。抗体动态特征分析以检测OD值作为观察指标，为便于观察将标本检测OD值/0.05后，计算均值和标准差。采用SPSS16.0软件进行统计分析，定性资料采用R*C列表卡方检验，P<0.05认为组间差异有统计学意义。

2　结果

2.1疑似病例血标本检测结果分析SFTS疑似患者血清87份，经荧光定量PCR检测核酸阳性46份，阳性率为53.41%。IgM抗体阳性27份，阳性率为31.03%, IgG抗体阳性3份，阳性率为3.41%。病毒核酸或抗体检测阳性标本合计55份，其中病毒核酸和IgM抗体均为阳性19份，病毒核酸和IgM抗体均阴性血清1份，两种方法检测的一致率为36.36%，经统计学分析，两种方法检测结果差异有统计学差异(χ2=6.82，P=0.009)，kappa值=-0.257,一致性较低，详见表1。

表1　发热伴血小板减少综合征病毒核酸与IgM抗体检测结果比较

55份实验室诊断病例，核酸检测发现7～9 d采集标本阳性率最高，12 d后采集标本核酸检测为阴性，经统计学分析，不同时间采集标本，核酸检测阳性率差异有统计学意义(χ2=10.35，P=0.016)，详见表2。

表2　发热伴血小板减少综合征确诊病例血标本病毒核酸检出情况与采样时间间隔相关性分析

2.2双份血标本检测结果比较对其中34例病毒核酸阳性病例进行随访，采集恢复期血清，核酸检测均为阴性。IgM抗体阳转8例，占23.53%(8/34), IgM抗体转阴8例，占23.53%(8/34)，IgG抗体阳转32例，占94.12%(32/34)。与急性期(38.23%)比较，恢复期IgM抗体阳性14份，阳性率为41.18%，差异无统计学意义(P=1.00)，详见表3。IgG抗体阳性32份，阳性率为94.12%，明显高于急性期IgG抗体阳性率(0%)。

图1　发热伴血小板减少综合征抗体动态特征及抗体阳性检出情况Fig.1　The trend of antibody titer and positive rates of IgM and IgG antibodies of SFTSV

IgM抗体恢复期IgM抗体阳性恢复期IgM抗体阴性急性期IgM抗体阳性58急性期IgM抗体阴性912

注：统计分析采用精确概率法检验

Note: The statistical analysis is tested by Fisher’s exact probabilities method

2.3病毒特异性IgM、IgG抗体动态特征对34对血清标本进行IgM和IgG抗体动态特征观察，IgM抗体在发病第2天即可检出，最晚检出时间为发病后第74天，30～60 d内采集标本，IgM抗体阳性率达75%，60 d后IgM抗体阳性率迅速下降为22.22%。30～60 d时间组，吸光度均值和抗体阳性率最高，详见图1。IgG抗体最早检出时间为发病后第12天，最晚检出时间为发病后100 d。30 d内采集标本IgG抗体阳性率仅为2.78%，30 d以后采集标本IgG抗体阳性率和吸光度均值均快速上升，并保持较高水平，30～60 d时间组IgG抗体阳性率为100%，如图1所示。

3　讨论

一般病毒感染机体后，首先出现病毒血症期，随后刺激机体产生抗体，IgM抗体是免疫应答中首要分泌的抗体，持续时间较短，为现症感染和早期诊断的指标，IgG抗体出现时间通常较晚，且持续时间较长，一般用于回顾性调查和作为既往感染的指标。不同的病毒具有自身特性，其病毒血症期持续时间以及抗体出现时间和持续时间不同，开展相关动态特征的研究，可以为确定标本的采集时间和检测方法的正确选择提供理论依据。发热伴血小板减少综合征防治指南(2010版)实验室检测方案中规定该病的诊断方法包括病原学和血清学方法，其中病原学方法包括：RT-PCR 和Real-time PCR病毒核酸诊断方法、病毒分离培养。血清学方法包括：血清特异性IgG抗体(ELISA、免疫荧光抗体测定、中和试验等方法)、血清特异性总抗体(双抗原夹心ELISA法检测)[3]，而这些方法的适用条件并没有进行详细的描述，基层医疗卫生机构在选择和使用相应检测技术时可能存在困惑。由于实时荧光定量PCR技术和ELISA技术具有快速、操作简便的特点，因此本研究主要分析两种检测技术对病毒RNA和特异性抗体的检测结果，另有研究表明SFTS病毒核蛋白具有较好的免疫原性[10]，所以本文选择核蛋白为基础的ELISA检测方法来观察抗体的动态特征。

本次研究发现，SFTS疑似病例早期标本中核酸检测有较高的阳性检出率(52.87%)，研究结果与杜燕华、宫连凤等一致[11-12]，并且SFTS病毒引起的病毒血症期持续时间较长，阳性标本采样与发病时间间隔均在12 d以内，其中7～9 d采集标本，阳性检出率最高，达100%，而IgM抗体(31.03%)和IgG抗体(3.41%)检出率相对较低，并且IgM抗体检测和PCR检测结果一致率较低。主要考虑两方法检测的目标物不同，以及抗体出现时间较晚有关。34份确诊病例恢复期血标本检测发现，IgM抗体阳性率为41.18%，与急性期比较差异无统计学意义(P=1.00)，而IgG抗体的阳转率高，达94.12%。黄学勇等[9]研究发现间接免疫荧光法检测SFTS疑似病例双份血，IgG抗体阳性率达76.19%，与RT-PCR的检测阳性率差异无统计学意义，结论与本研究基本一致，说明双份血IgG抗体的检测对于疾病的诊断具有重要价值。

抗体水平动态特征分析发现：IgM抗体在发病第2天即可检出，最晚检出时间为发病后第74天，30～60 d内采集标本，IgM抗体阳性率最高(75%)。IgG抗体最早检出时间为发病后第12天，发病后100 d采集标本中仍能检出，30 d内采集标本IgG抗体检出率仅为2.78%，30 d以后采集标本，IgG抗体检出率和吸光度均值均快速上升，并保持较高水平，研究结果与刘艳等研究结论不一致[13]，其研究发现28例SFTS患者中，IgM、IgG抗体阳性检出率分别为89.3%和85.7%，两种抗体发病后5 d开始出现，峰值出现在发病2周左右，考虑其观察病例少，随访时间过短有关。另有研究显示该病毒中和抗体在SFTS住院病例中可持续4年甚至更长时间[14]，本研究亦未发现IgG抗体下降的拐点，需要进一步研究。

综上所述，发病两周内采集的SFTS疑似患者血标本，可优先考虑使用实时荧光PCR方法等检测病毒核酸或检测IgM抗体。与汉坦病毒等布尼亚病毒不同的是，IgM抗体虽可在发病2 d后检出，但检出高峰出现时间多较晚，因此检测阴性并不能排除诊断。IgG抗体在恢复期标本中阳转率高，可作为疾病诊断的辅助手段。

利益冲突：无

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