王海波， 李　璐， 苏新国， 张昭其， 庞学群

(1.广东食品药品职业学院，广东广州 510520； 2.华南农业大学生命科学学院，广东广州 510642；3.华南农业大学园艺学院，广东广州 510642)

香蕉果实在贮藏温度低于12 ℃时即发生冷害，难以采用较低的温度来延长贮运期[1-2]。热处理是提高果蔬抗冷性的最有效的采后处理措施之一[3]，但热处理诱导的抗冷机制目前尚不明确。钙调素(calmodulin，CaM)是植物中重要的第二信使，CAMTA(calmodulin-binding transcription activator)/SR (signal responsive transcription activator)是一类广泛存在于真核生物中的含有CaM结合位点的转录因子家族。CaM和CAMTA在植物响应逆境中起调节作用，对香蕉CaM和CAMTA 的深入研究，有助于进一步了解香蕉钙信号系统调节的分子机制，有助于揭示热处理提高香蕉果实抗冷性的作用机理。CaM参与了植物对高温、低温胁迫等的响应，并且在植物细胞对胁迫的适应过程中起重要调节作用[4-5]。热、冷、干旱等多种胁迫都能诱导CAMTA基因上调表达[6-7]。拟南芥CAMTA3能同CBF2(C-repeat binding transcription factor)启动子区域CM2序列(CCGCGT)结合，激活CBF2等基因的表达，从而提高拟南芥的抗冷性[8]。笔者所在课题组的前期研究结果表明，采用52 ℃热水处理香蕉果实3 min，能有效减轻香蕉果实的冷害症状[9-10]，但有关CaM和CAMTA在热水处理诱导香蕉抗冷性中的作用目前还不明确。分析CaM和CAMTA基因在香蕉热处理和低温贮藏中的表达情况，探讨这2个基因在热处理诱导香蕉抗冷性中的作用，为有效延长香蕉贮运期提供参考依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料及处理

香蕉品种为巴西(Musaspp. AAAGroupcv.cavendish)，采自广东省广州市番禺香蕉园，及时运回广东省果蔬保鲜重点实验室。挑选七成饱满、大小均匀、无病虫害及机械损伤的单个香蕉， 先后用0.1%漂白粉和0.05%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂各浸泡5 min，晾干后备用。

热水及低温贮藏处理：将香蕉果实浸入热水处理机(体积400 L)中，温度52 ℃，时间3 min。热水处理后将香蕉果实放入20 ℃恒温箱中贮藏3 h，然后置于7 ℃下贮藏5 d；对照处理的香蕉在20 ℃恒温箱中贮藏3 h，然后置于7 ℃下贮藏5 d。每个处理100个香蕉，定期取样备用。取样时间点为：20 ℃下0、0.5、1.5、3.0 h；7 ℃下1.0、4.0、8.0、24.0、48.0、120.0 h。

1.2　试验方法

1.2.1脯氨酸含量测定参照Demiral等的试验方法[11]，略有改动。取香蕉果皮0.5 g，用5 mL 3%磺基水杨酸提取，沸水浴10 min，冷却。5 000 r/min离心10 min，取上清液待测。测定：取2 mL上清液，加2 mL水、2 mL 3%磺基水杨酸、2 mL冰乙酸和4 mL 2.5%茚三酮，沸水浴显色30～60 min，冷却。加4 mL甲苯萃取，静置后取甲苯相测定520 nm下的吸光度(以甲苯为空白对照)。根据下式计算脯氨酸含量：单位鲜质量样品中脯氨酸含量(μg/g)=2.5C/W，式中：C为样品脯氨酸浓度，μg/mL；W为样品质量，g；2.5表示溶液体积为 2.5 mL。

1.2.2实时定量引物设计根据已经克隆得到的MaCaM和MaCAMTA3基因序列，设计实时定量引物，验证后备用。引物序列为MaCaM(5′-ACCGAAGCTGAGCTACAG-3′、5′-ATCCTTCATCTTGCGAGC-3′)和MaCAMTA3(5′-GCAA ATGGTCACAAAGGC-3′、5′-GAGAAGCATTCCGAACAG-3′)。

1.2.3实时荧光定量PCR(qRT-PCR)采用TOYOBO THUNDERBIRD SYBR®qPCR Mix 进行qRT- PCR扩增。反应体系为20.0 μL，即SYBR-Green PCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.25 μL，稀释的cDNA 2.0 μL，ddH2O 7.5 μL。扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40个循环。为了确认产物的质量和引物的特异性，在溶解曲线中分析产物的Tm(分析溶解温度为65～95 ℃)。所有qRT-PCR结果根据内参基因Actin1进行Ct值校准，再利用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量，重复3次。

1.3　数据处理

采用Sigmaplot 12.5制作折线图。

2　结果与分析

2.1　热激处理及热激后低温贮藏对脯氨酸含量的影响

前期研究表明，7 ℃(冷害温度)下，香蕉果实在处理后 5 d 已经出现明显的冷害症状，利用52 ℃热水处理(HWD) 3 min 能有效提高香蕉果实在7 ℃低温贮藏中的抗冷性[9-11]。从图1可知，对照香蕉果实的脯氨酸含量在7 ℃下呈现缓慢上升的趋势。热激处理后在20 ℃贮藏期间，香蕉果实的脯氨酸含量小幅度逐渐增加，且脯氨酸含量略高于对照。当热激后的香蕉果实转入7 ℃下1 h时，脯氨酸含量迅速增加至20 ℃贮藏时的3倍左右，之后呈现出下降上升再下降的趋势，在整个7 ℃低温贮藏期间，热激处理的香蕉果实其脯氨酸含量一直明显高于对照。

2.2　热激处理及热激后低温贮藏对MaCaM表达的影响

从图2可知，对照处理的MaCaM基因表达在7 ℃下1 h迅速升高至最大值，之后又在7 ℃ 4 h迅速下降，后期持续在同一个水平，但表达量仍高于20 ℃下的表达量。香蕉果实经过HWD处理后，MaCaM基因表达呈现快速升高的趋势，在20 ℃下3 h达到一个高峰，MaCaM基因表达量约为对照的2倍。当热激后的香蕉果实中转入7 ℃低温贮藏1 h时，MaCaM基因表达量迅速下降至0 d的水平，这与对照的表现相反。7 ℃低温4～8 h时，MaCaM基因表达量迅速增强至最高峰，之后逐渐下降。除7 ℃贮藏1、4 h外，热激处理的MaCaM基因表达量均高于对照。

2.3　热激处理及热激后低温贮藏对MaCAMTA3表达的影响

从图3可知，对照处理的MaCAMTA3基因在7 ℃贮藏下1～8 h呈现逐渐下降趋势，7 ℃贮藏8～24 hMaCAMTA3基因表达又增强至20 ℃贮藏时的水平，之后又开始逐渐下降。香蕉经HWD处理后3 h，MaCAMTA3基因表达逐渐升高至最大值，约是对照处理的1.4倍，然而当果实转入7 ℃后1 h，MaCAMTA3基因表达量出现短暂而迅速的下降，且低于对照。之后其表达量逐渐上升，在7 ℃ 8～24 h达到一个高峰，之后又开始逐渐下降。除7 ℃贮藏1、4 h外，HWD处理的MaCAMTA3基因表达均高于对照。

3　结论与讨论

脯氨酸含量的积累与果实抗冷性的提高密切相关[12]。桃果实中较高的脯氨酸含量明显提高了桃果实的抗冷性，而且用外源5 mmol/L脯氨酸处理桃果实，能明显降低桃果实冷害指数，缓解其冷害症状的发生[13]。10 mmol/L甜菜碱处理可提高黄瓜果实中脯氨酸含量，从而减轻黄瓜果实贮藏期间的冷害[14]。外源NO处理能够通过促进香蕉果实脯氨酸积累和增强体系的抗氧化性，进而减轻香蕉冷害[15]。本研究也发现，热激能在处理后3 h内轻微增加香蕉果实脯氨酸的含量，而当果实经热激处理后在7 ℃低温贮藏时，其脯氨酸含量一直明显高于对照处理，说明热激诱导的脯氨酸大量积累与香蕉果实的抗冷性密切相关。

热激处理能在短时间内迅速激活CaM的表达。例如，拟南芥幼苗经过37 ℃热激后，其AtCaM3基因表达水平在 20 min 内迅速增加并达到最大值，在30 min后逐渐下降[16]。37 ℃处理玉米幼苗后，其CaM1-2的表达在10 min后开始迅速增强[4]，本研究也发现，香蕉果实经过热激处理后，MaCaM基因表达呈现快速升高的趋势，在处理后3 h达到一个高峰。CaM也参与了植物的低温胁迫反应。例如，茶树在4 ℃低温胁迫下，CsCaM1与CsCaM2基因的表达量从3 h开始逐渐上升，于24 h达到最大值[17]。 4 ℃低温能诱导小麦幼苗TaCaM5的表达量在1 h后迅速升高，3 h达到最高峰，之后又迅速下降至处理前的水平[18]。本研究结果与之类似，7 ℃ 低温诱导香蕉果实的MaCaM基因表达在1 h迅速升高至最大值，之后又在4 h迅速下降，后期维持在一个较低的水平。而经热激处理后在7 ℃低温贮藏的香蕉果实，MaCaM基因表达高峰推迟出现在4 h，除低温贮藏1、4 h外，热激处理的MaCaM基因表达均高于对照。以上结果说明，MaCaM可能参与了热激处理诱导香蕉果实抗冷性的过程。

热处理和低温都能诱导CAMTA基因的表达。42 ℃热处理能诱导拟南芥幼苗的AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6这5个基因在15 min开始上调表达，尤其是AtCAMTA1、AtCAMTA5、AtCAMTA6这3个基因在热处理4 h内均维持较高的表达水平。类似地，4℃低温也能诱导拟南芥幼苗AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6这5个基因的上调表达，尤其是AtCAMTA1、AtCAMTA3、AtCAMTA5、AtCAMTA6这4个基因在低温处理4 h内均保持较高的表达水平[6]。本研究也发现，热处理能诱导香蕉果实MaCAMTA3基因表达在处理后3 h内迅速增强，7 ℃ 低温贮藏下MaCAMTA3基因表达呈现先下降后上升再下降的趋势，而经过热激处理后在7 ℃低温贮藏的香蕉果实，除低温贮藏1、4 h外，MaCAMTA3基因表达均高于对照。说明热激处理诱导MaCAMTA3基因较高的表达水平，可能参与了热激处理诱导香蕉果实产生的抗冷性。

热处理能诱导香蕉果实在低温贮藏中的脯氨酸含量升高，从而提高果实抗冷性。MaCaM和MaCAMTA3基因可能参与了热激处理诱导香蕉果实产生的抗冷性。

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