南锡浩 于峰 田河 马瑞 张智慧 张月顺

[摘要] 目的 探討分析白花蛇舌草的提取物在膀胱癌EJ细胞株增殖抑制中发挥的作用及其机制。方法 将2016年5月—2017年5月培养的的膀胱癌EJ细胞株按照随机数字法分为对照组和研究组，对照组不加任何物质，研究组的细胞株加入白花蛇舌草的提取物，利用MTT法测定细胞的增殖抑制作用，并利用流式细胞仪检测膀胱癌EJ细胞株的端粒酶含量，观察对比两组细胞株的生长抑制率以及端粒酶的含量。 结果 研究组的EJ细胞株加入白花蛇舌草提取物12、24、48、72 h的生长抑制率分别为（7.38±0.49）、（11.94±0.78）、（18.46±0.24）、（28.76±0.57），均明显高于对照组的（5.14±0.38）、（7.96±0.98）、（12.64±0.37）、（15.79±0.76）（P<0.05）；而研究组细胞株12、24、48、72 h的端粒酶含量分别为（33.13±1.84）、（25.46±2.79）、（15.34±2.13）、（9.54±1.79），均明显低于对照组的（37.16±2.31）、（31.91±2.78）、（18.49±1.4）、（12.48±2.07）（P<0.05）。结论 白花蛇舌草中的提取物应用于膀胱癌EJ细胞中能够有效抑制细胞的增殖作用，作用机制与端粒酶的含量有关，是一种抗肿瘤的新型药物，在临床上值得进一步推广应用，有巨大的参考价值。

[关键词] 白花蛇舌草；膀胱癌EJ细胞株；抑制增殖；端粒酶

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2018）01（a）-0001-03

Inhibitory Effect of Hedyotis Diffusa on Proliferation of Bladder Cancer Cell Line EJ and Its Mechanism

NAN Xi-hao1， YU Feng1， TIAN He1， MA Rui1， ZHANG Zhi-hui1， ZHANG Yue-shun2

1.Department of Urology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China； 2.Department of Anesthesiology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical College， Mudanjiang， Heilongjiang Province， 157011 China

[Abstract] Objective This paper tries to investigate the role and mechanism of extract of Hedyotis diffusa in inhibiting the proliferation of bladder cancer EJ cell line. Methods The bladder cancer EJ cell lines cultured from May 2016 to May 2017 in experimental operation were divided into control group and study group according to random number method， control group without any material， the team of cell lines to join the spreading hedyotis herb extract， determination of cell proliferation inhibition by the MTT method， and by using flow cytometry instrument to detect the contents of bladder cancer EJ cell lines of telomerase， observation compared two groups of cell lines growth inhibition rate and the content of telomerase. Results The growth inhibition rate of EJ cell line added to the extract of Hedyotis diffusa were （7.38±0.49），（11.94±0.78）， （18.46±0.24） and （28.76±0.57） at 12， 24， 48 and 72 h， respectively， which were significantly higher than that of the control group （5.14±0.38）， （7.96±0.98）， （12.64±0.37）， （15.79±0.76） （P<0.05）， while the telomerase contents in the study group at 12， 24， 48 and 72 h were （33.13±1.84） （25.46±2.79）and （15.34±2.13），（9.54±1.79）were significantly lower than the control group （37.16±2.31）， （31.91±2.78）， （18.49±1.49）， （12.48±2.07） （P<0.05）. Conclusion Of spreading hedyotis herb extract used in bladder cancer EJ cells can effectively inhibits the proliferation of cells， the mechanism of action is associated with the levels of telomerase， is a new type of antitumor drug， worthy of further popularization and application in clinic， has great reference value.

[Key words] Hedyotis diffusa； Bladder cancer EJ cell line； Inhibition of proliferation； Telomerase

膀胱癌通常是發生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，也是泌尿系统中最为高发多见的疾病，膀胱癌在任何年龄都有发病的可能，发病率近年来随着年龄的增长呈逐渐升高的趋势，而且男性膀胱癌发病率大约为女性的3～4倍，膀胱癌患者的临床表现是无痛性、肉眼可见、间歇性血尿，出现排尿困难，严重影响患者的生活质量[1]。膀胱癌属于移行细胞癌，手术后患者会在很短时间内再次复发，并且有病情加重的危险，该疾病应用手术治疗不能获得满意的疗效，所以一般会采用化疗辅助治疗膀胱癌，常用化疗药物为丝裂霉素、吡柔比星、卡介苗等，但是化疗药物在杀死肿瘤细胞的过程中也会杀伤正常细胞，给患者带来严重的不良反应。白花蛇舌草药味偏苦、淡，性寒，有着清热解毒、利尿除湿、消痛散结的良好功效，善于治疗各种炎症。现代药理实验研究表明，白花蛇舌草提取物通过激活T细胞，释放大量的干扰素，从而抑制肿瘤细胞的增殖作用，除此之外，白花蛇舌草提取物还能够增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，能够促使机体增强防御功能。该研究选取2016年5月—2017年5月培养的的膀胱癌EJ细胞株，旨在探讨分析白花蛇舌草提取物在膀胱癌EJ细胞株增殖抑制中发挥的作用及其机制，从而为膀胱癌的治疗提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验材料 细胞来源为人膀胱癌EJ细胞株、从中药房购买白花蛇舌草，将药草浸泡后煮沸一段时间，过滤后将提取液浓缩后配比加入乙酸乙酯和乙醇，来回抽滤后获得纯度较高的提取物，然后放入冰箱待用[2]。

1.1.2 实验仪器 CO2恒温电热培养箱、超净工作台、低速离心机、细胞培养瓶、流式细胞仪、倒置显微镜、旋转蒸发仪、微孔滤器、低温冰箱、振荡器。

1.1.3 实验试剂 RPMI1640培养基、新生牛血清、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、单克隆抗体等。

1.1.4 利用随机数字法 将膀胱癌EJ细胞株分为对照组和研究组，在实验前进行同步培养，使其生长的环境完全相同[3]。该实验符合细胞相关实验的规定，两组细胞株的一般资料对比差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 细胞实验 先培养对照组和研究组的细胞株，膀胱癌EJ细胞株是单层细胞，并且贴壁生长，将细胞株在含有胎牛血清、链霉素、青霉素的RPMI1640培养基中培养，并将培养瓶放入CO2恒温电热培养箱，培养至细胞的指数生长期时进行实验。对照组细胞株中不需要加入任何物质，只需每日更换培养液，隔一天对细胞进行传代，而研究组的细胞株接种培养到一定阶段时，加入白花蛇舌草提取物，继续放入细胞培养箱中培养，待细胞进入指数生长期后进行实验[4]。

1.2.2 细胞毒性实验 用MTT法测定白花蛇舌草提取物对于肿瘤细胞的增殖抑制作用，首先取指数生长期EJ细胞株用胰酶消化后接种于96孔细胞板上，在CO？恒温电热培养箱中培养24 h，吸弃原培养液后加入胎牛血清培养，一段时间后每孔加入MTT25 μL，继续孵育4 h，再将上清液弃去，每孔再加入100 μL二甲基甲砜，利用振荡仪使结晶物溶解充分，最后用联免疫检测仪测出两组细胞的吸光度A值[5]。细胞抑制率=（1-研究组A值/对照组A值）×100%。

1.2.3 定量检测两组细胞株的端粒酶含量 将对照组和研究组的膀胱癌EJ细胞株中加入单克隆抗体，并在CO？恒温电热培养箱中孵育30 min，去上清后，放入冰箱中保存24 h后，利用仪器检测端粒酶的含量[6]。

1.3 观察指标

计算两组膀胱癌EJ细胞株的细胞抑制生长率，细胞抑制率由MTT法检测出的细胞吸光度代入公式得出。此外用流式细胞仪测出两组膀胱癌EJ细胞株的端粒酶含量，比较分析实验结果。

1.4 统计方法

数据应用SPSS 18.0统计学软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，进行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

研究组细胞株的肿瘤细胞生长抑制率明显高于对照组（P<0.05），见表1。

研究组细胞株的端粒酶含量显著低于对照组（P<0.05），见表2。

3 讨论

膀胱癌属于移行细胞癌，是泌尿系统常见高发的恶性肿瘤，具有发病率高、致死率高、复发率高的特点，癌细胞呈浸润性生长，且男性发病率远高于女性，临床上对于膀胱癌的治疗方式仍以手术、化疗为主，化疗的常用药物为丝裂霉素、阿霉素、干扰素、吡柔比星、卡介苗等，但是这些治疗手段仅能暂时延长患者的寿命，一段时间后仍会复发而且有加重病情的危险，这些抗癌药物都是通过一级动力学原理来杀灭肿瘤细胞，阻断肿瘤细胞的增殖生长，诱导细胞凋亡，从而达到治愈疾病的目的[7]。但是肿瘤细胞的繁殖率相当高，残存的细胞成为诱发癌症复发的主要原因，所以说寻找具有高诱发癌细胞凋亡，遏制细胞生长繁殖的高效抗肿瘤药物在临床治疗中有着重要的意义，能够有效预防疾病的发展。

白花蛇舌草中药味偏苦，偏淡，属于性寒植物，具有清热解毒、利尿除湿的功效，常用于治疗各种炎症[8-9]。该研究将白花蛇舌草提取物加入研究组，对照组不加任何物质进行细胞毒性实验以及端粒酶含量的测定，观察两组细胞株对于膀胱癌肿瘤细胞的抑制作用及其作用机制， 数据显示72 h后研究组的肿瘤细胞生长抑制率为（28.76±0.57），显著高于对照组的抑制率（15.79±0.76）（P<0.05）；72 h后研究组的端粒酶含量为（9.54±1.79），显著低于对照组的（12.48±2.07）（P<0.05）。中国老年学杂志发表的《白花蛇舌草对膀胱癌EJ细胞株的增殖抑制作用及其机制》中也做过类似的实验，选择不同浓度的白花蛇舌草提取物分不同的时间段作用于膀胱癌EJ细胞株，72 h后1.5 μg/L的肿瘤细胞抑制率达到峰值（53.24±4.03），流式细胞仪检测加药后对照组端粒酶含量为（42.465±3.987），实验组0.5、1、1.2、1.5 μg/L组端粒酶含量分别为（33.580±1.842）、（25.710±3.222）、（15.334±2.555）、（9.118±1.874）。与该实验不同的是没有分对照组和研究组，只选取不同浓度的白花蛇舌草提取物进行研究对比，但是都说明了随着时间的推移以及浓度的增加，白花蛇舌草在肿瘤细胞增殖抑制中发挥的作用越来越强，端粒酶的含量也在显著下降。

研究发现，白花蛇舌草提取物抑制肿瘤细胞生长繁殖的作用机制是通过减少端粒酶含量来实现的，端粒是由真核细胞染色体内一段重复串联的DNA序列和相应的蛋白质组成的，在细胞分裂增殖时，端粒的末端会逐渐缩短，它的功能是维持染色体的恒定，随着细胞的复制，端粒缩短到一定程度时无法行使它的功能，最终诱导癌细胞停止增值死亡[10]。而端粒酶是一种核糖蛋白酶，补充作用于逐渐缩短的染色体末端，所以说肿瘤的恶化程度越高，端粒酶活性越高，含量越多。实验中通过用流式细胞仪测定两组细胞株的端粒酶含量，可以分析得到白花蛇舌草提取物抗肿瘤、抑制癌细胞生长繁殖的作用。

综上所述，通过细胞毒性实验MTT法以及流式细胞仪的测定，充分证明白花蛇舌草提取物对于肿瘤细胞的生长抑制、减少端粒酶数量、降低端粒酶活性都发挥着重要的作用，为临床上治疗膀胱癌提供了参考，临床上应当进一步推广应用。

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（收稿日期：2017-10-08）