张艳霞，李跃辉，张丽红，张年萍，闫燕艳，杨小会，冯湘玲

(1.山西大同大学医学院，山西 大同037009； 2.中南大学基础医学院肿瘤研究所，湖南 长沙410078；3.中南大学湘雅公共卫生学院，湖南 长沙410078)

同源盒 (homeobox,HOX)基因最初是在研究果蝇的胚胎发育调控过程中被发现，是形态发生、细胞分化和维持成体细胞稳定的主要调节基因，其绝大多数分散在整个基因组，只有39个HOX基因，即HOX基因家族，有序地排列在特定的染色体上[1]。越来越多的研究显示：HOX基因表达改变与多种实体肿瘤密切相关，如肺癌[2]、乳腺癌[3]和口腔癌[4]等。Cillo等[5]研究发现：HOXA13在肝癌样本中高表达，而在相对应的癌旁组织中低表达，但对于HOXA13在肝癌发生发展过程中的作用目前少有报道。本研究采取RNA干扰技术，使HOXA13基因在肝癌细胞中低表达，进而从基因水平研究HOXA13对肝癌细胞恶性表型的影响。

1　材料与方法

1.1细胞和主要试剂人肝癌细胞株HepG2和 QGY-7703购自中南大学细胞中心。plent-U6-GFP载体(山东维真生物技术有限公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，嘌呤霉素(研科生物试剂公司)，RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)，细胞培养板、MTT和DMSO(北京鼎国昌盛技术有限责任公司)，Lipofectamine 2000 Reagent(上海英维捷基贸易有限公司)，Giemsa染料和碘化丙啶(PI)(美国Sigma公司)。

1.2plent-U6-GFP/si-HOXA13重组载体构建从GenBank中提取HOXA13基因序列 (序列号：NM_000522 )，设计、合成HOXA13基因的干扰序列

5′-CAGAATCGTATTGGTTACA-3′，并定向克隆入plent-U6-GFP载体，构建plent-U6-GFP/si-HOXA13重组载体，并以空载体plent-U6-GFP为对照。

1.3细胞转染将HepG2和QGY-7703细胞接种于24孔细胞培养板；第2天转染，具体操作方法参照脂质体2000(Lipofectamine 2000)产品说明书。A液制备：分别取2 μL Lipofectamine 2000与48 μL无血清RPMI-1640培养基轻轻混匀，37℃、5%CO2培养箱放置5 min；B液制备：分别取1 μg重组质粒plent-U6-GFP/si-HOXA13和1 μg对照质粒plent-U6-GFP与49 μL无血清RPMI-1640培养基轻轻混匀，37℃、5%CO2培养箱放置5 min；将A液和B液混匀，静置25 min；将待转染的HepG2和QGY-7703细胞用D-Hank’s液洗1次，然后加入450 μL无血清RPMI-1640，再分别将上述A 液和B液混合溶液加至板中，混匀后培养4～6 h；换新鲜的无抗生素的RPMI-1640，48 h后传代，然后加含1 mg·L-1嘌呤霉素的RPMI-1640筛选阳性克隆。

1.4RT-PCR法鉴定HOXA13干扰效果按 FERMENTAS产品说明书进行，具体操作如下：取细胞总RNA 2 μg，加Oligo(dt)18引物1 μL，加无Rnase的去离子水12 μL，轻轻混匀后，70℃、5 min；迅速将取出的PCR管放于冰上冷却，再加入5×Reaction buffer 4 μL，Ribonuclease inhibitor 1 μL和dNTP mix 2 μL，轻轻混匀后，70℃、5 min；再加1 μL RevertAidTMM-MuLV Reverse transcriptase，轻轻混匀，42℃、 60 min，70℃ 、10 min，反应终止后进行PCR。PCR条件：95℃ 、1 min预变性；95℃、30 s，60℃、30 s，68℃、90 s，循环28次；68℃延伸10 min。PCR扩增产物，采用1% Agaross凝胶(含0.8%Goldview)电泳进行鉴定。人HOXA13引物：正向引物5′-GGCCTTACCACCACCATCAG-3′，反向引物5′-TGGCGTATTCCCGTTCAAGT-3′，扩增产物片段长度为315 bp。GAPDH 引物：正向引物5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，反向引物5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′，扩增产物片段长度为580 bp。

1.5Western blotting法鉴定HOXA13干扰效果分别制备5%的浓缩胶和10%的分离胶；样品制备：分别取50 μg蛋白样品，加5%的巯基乙醇，在100℃下煮沸5 min；电泳：先在70 V电压下电泳约30 min，然后在100 V电压下电泳约2 h；转膜：分别将滤纸、SDS-PAGE胶、转印膜、滤纸按负极到正极的顺序放置在转膜装置上，100 mA转膜2 h；抗体孵育：将转印后的转印膜置于封闭液中，4℃过夜。将转印膜取出，放于含1∶400稀释的Rabbit Anti-Human HOXA13的抗体溶液中，置于恒温摇床上反应2 h，将膜取出漂洗3次， 每次3～5 min，再加1∶3 000稀释的Mouse Anti-Rabbit IgG-HRP的抗体溶液中，置于恒温摇床上反应 1 h ；PBST漂洗3次，每次3～5 min；暗室内进行曝光、显影和定影；胶片扫描。

1.6实验分组以HOXA13基因沉默的HepG2和 QGY-7703细胞(HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13)为实验组，以转染空质粒的HepG2和 QGY-7703细胞(HepG2/C和QGY-7703/C)为对照组。

1.7MTT法检测细胞生长速度各组细胞均按5×103/孔的数量分别接种于96孔板，然后在培养箱中放置24 h；分别加MTT(终浓度为5 g·L-1)，再继续培养4 h；吸尽上层液体，再分别加入200 μL DMSO，约8 min后，酶标仪490 nm处测吸光度(A)值。以A值为纵轴，时间为横轴绘制HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C细胞生长曲线图，比较2组细胞的生长速度。

1.8细胞倍增时间检测实验组和对照组细胞以1×103个细胞/孔接种于24孔板，第2天收集细胞并计数。按以下计算公式计算HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C细胞的平均倍增时间：TD=t[lg2/(lgNt1-lgN0)](TD为细胞倍增时间，t为培养时间，N0、Nt分别代表接种后及培养t小时后的细胞数)。

1.9平板克隆形成能力检测实验组和对照组细胞均按1 000个细胞/孔接种于6孔板，在培养箱中放置2～3周；终止培养后，甲醇固定15 min；Giemsa染色15 min，洗去染色液，空气风干；计算克隆数(多于50个细胞者为1个克隆)。

1.10细胞周期检测将实验组和对照组细胞以5×104个接种于培养瓶，24 h后，用不完全培养基培养12 h；再换完全培基，第2天收集细胞，用D-Hank’s液将细胞漂洗2次，PI染色25～35 min。流式细胞仪分析细胞周期分布情况。

2　结　果

2.1沉默HOXA13基因细胞系的构建分别将重组质粒plent-U6-GFP/si-HOXA13和对照质粒plent-U6-GFP用Lipofectamine 2000转染HepG2和 QGY-7703细胞，经2 mg·L-1嘌呤霉素筛选约14 d，挑单克隆扩大培养，首先采用RT-PCR法分别检测HepG2/plent-U6-GFP/si-HOXA13、HepG2/plent-U6-GFP、QGY-7703/ plent-U6-GFP/si-HOXA13和QGY-7703/ plent-U6-GFP细胞中的HOXA13 mRNA表达水平，结果显示：实验组HepG2/plent-U6-GFP/si-HOXA13和QGY-7703/plent-U6-GFP/si-HOXA13细胞中HOXA13 mRNA表达水平明显低于对照组，而对照组HepG2/plent-U6-GFP和QGY-7703/plent-U6-GFP细胞HOXA13 mRNA水平明显无变化(图1 A和B)，分别将HepG2/plent-U6-GFP/si-HOXA13、QGY-7703/plent-U6-GFP/si-HOXA13、HepG2/ plent-U6-GFP和QGY-7703/ plent-U6-GFP细胞系命名为HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C。进一步采用Western blotting法分别检测实验组和对照组HepG2/si-HOXA13、QGY-7703/si-HOXA13、HepG2/C和QGY-7703/C细胞中HOXA13蛋白表达水平，结果显示：实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞中HOXA13蛋白表达水平明显低于对照组(图1 C和D)，结果与RT-PCR法检测结果一致。说明沉默HOXA13细胞系建立成功，可用于后续实验。

Lane 1:HepG2/C cells; Lane 2:HepG2/si-HOXA13 cells; Lane 3:QGY-7703/C cells: Lane 4:QGY-7703/si- HOXA13 cells.

图1RT-PCR (A,B) 和Western blotting (C,D)法检测稳定转染plent-U6-GFP/si-HOXA13和plent-U6-GFP细胞中HOXA13表达电泳图

Fig.1Electrophoregram of expressions of HOXA13 in cells transfected with plent-U6-GFP/si-HOXA13 and plent-U6-GFP detected by RT-PCR(A,B) and Western blotting(C,D) methods

2.22组细胞生长曲线与对照组HepG2/C和QGY-7703/C细胞比较，实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞的生长速度明显下降。见图2。

图2MTT法检测2组HepG2(A) 与QGY-7703 (B) 细胞的生长曲线

Fig.2Growth curves of HepG2(A) and QGY-7703(B) cells in two groups detected by MTT method

2.32组细胞倍增时间HepG2/C和HepG2/si-HOXA13细胞平均倍增时间分别为(4.59±0.27)和(6.02±0.86 )h；QGY-7703/C和QGY-7703/si-HOXA13细胞平均倍增时间分别为(4.93±0.17)和(6.43±0.66)h；实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞的平均倍增时间明显延长，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.42组细胞克隆形成数HepG2/C和HepG2/si-HOXA13细胞克隆形成数分别为(264.00±12.62)和(165.00 ±10.61)个；QGY-7703/C和QGY-7703/si-HOXA13细胞克隆形成数分别为(269.00±4.43)和(215.00±4.50)个；实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞克隆形成数明显低于对照组(P<0.01)。见图3。

2.52组细胞周期的分布HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞G1/G0期细胞比例分别是(59.90±3.10)%和(55.19±2.10)%；S期细胞比例分别是(25.00±2.17)%和(32.71±2.07)%；G2/M期细胞比例分别是(13.10±1.23)%和(12.10±1.23)%。而HepG2/C和QGY-7703/C细胞G1/G0期细胞比例分别是(52.72±3.26)%和(47.12±2.26)%；S期细胞比例分别是(34.56±2.77)%和(41.78±2.57)%；G2/M期细胞比例分别是(12.10±1.52)%、(11.10±1.49)%。与对照组比较，实验组HepG2/si-HOXA13和QGY-7703/si-HOXA13细胞G1期比例增多，S期细胞比例减少。见图4。

A,B:Control group;C,D:Experimental group;A,C:HepG2 cells; B,D:QGY-7703 cells.

A,B Control group; C,D Experimental group;A,C:HepG2 cells;B,D:QGY-7703 cells.

3　讨　论

HOX基因是调控机体发育、细胞增殖与分化的主要分子之一[6]，分为HOXA、HOXB、HOXC和HOXD 4种类型，各自排列在一条特定的染色体上[7]。越来越多的研究[8-10]显示：HOX异常与人类许多肿瘤的发生和进展有关联。Vider等[11]研究发现：HOXB6、HOXB8、HOXC8和HOXC9基因在结肠癌细胞CaCo-2和HT-29中表达上调。有研究[12]显示：HOXA1、HOXA5、HOXA10和 HOXC6基因在肺癌样本中的表达明显升高，其中以HOXA5和 HOXA10基因的差异表达尤为明显 。Kanai等[13]发现：HOXA9、HOXB3、HOXB8 和 HOXB9在肝癌样本中的表达明显升高。Quagliatat等[14]发现HOXA13在肝癌组织中高表达与肝癌预后不良有密切关联。

本实验结果显示：HOXA13基因沉默以后，HepG2和QGY-7703细胞的体外生长速度明显降低，细胞倍增时间明显延长，克隆形成能力也明显降低，表明可能是基因水平的改变导致了HOXA13蛋白表达减少，从基因水平印证了HOXA13可以使肝癌细胞的生长速度明显加快、细胞倍增时间明显缩短、克隆形成能力也明显增加，从而增殖速度加快、成瘤能力增加，加速了肿瘤发生发展的进程，导致其预后不良，与Quagliatat等[14]的研究结果趋势一致。另外，肝癌细胞的生长速度明显加快，细胞倍增时间明显缩短，而血管形成相对不足导致营养供应不足，从而肿瘤更容易发生出血、坏死等继发改变，更容易破坏局部组织和发生远处转移，这也是导致肿瘤不良预后的原因[15]。可见HOXA13可以使肝癌的恶性程度增加。

Gu等[16]研究HOXA13对食管鳞癌的促瘤作用发现：HOXA13沉默后，食管鳞癌细胞的克隆形成能力、裸鼠成瘤能力均明显降低。Li等[7]研究发现，HOXA7基因有效沉默后，HepG2和QGY-7703 细胞体外生长速度明显减慢，细胞周期也发生改变，即G1期细胞比例升高，S期细胞比例降低，裸鼠体内成瘤能力也下降，并且发现细胞周期蛋白E1和细胞周期蛋白2 表达水平也明显下降。且在正常肝细胞中采用基因重组的方法使 HOXA7 过表达后，肝细胞的体外增殖速度加快，细胞周期蛋白E1 和细胞周期蛋白2水平明显升高。说明HOXA7能促进肝细胞增殖，与细胞周期蛋白 E1和细胞周期蛋白2介导有关。本实验中HOXA13基因有效沉默后，HepG2和 QGY-7703细胞周期分布发生明显变化，G1期细胞增多，S期细胞减少，可能是HOXA13在HepG2和 QGY-7703细胞中的表达具有周期依赖性，以维持HepG2和 QGY-7703细胞的有丝分裂，其机制尚需进一步证实。

综上所述，有效沉默HOXA13后，可引起肝癌细胞周期阻滞、细胞倍增时间明显延长和增殖能力明显降低，说明HOXA13 在肝癌的发生发展过程中发挥了重要的作用，这为以HOXA13为靶点的肝癌诊断和治疗提供了新的理论依据及靶向策略。

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