刘 晶，王光函，张 颖，曹宏伟，庞 敏△

(1. 辽宁中医药研究院, 沈阳 110034； 2. 辽宁省疾病预防控制中心, 沈阳 110000)

辽藁本为辽宁产道地药材，在辽宁省清源县有大面积人工栽培。《中国药典》2015版记载，辽藁本为伞形科植物辽藁本LigusticumjeholenseNakaietKitag.的干燥根茎和根，其辛、温，归膀胱经，具有祛风、散寒、除湿、止痛之功效[1]，用于风寒感冒、巅顶疼痛、风湿痹痛。本研究采用气相色谱法，建立辽藁本中藁本内酯、正丁基苯酞的含量测定方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

7890 A气相色谱仪(Agilent公司)，冷冻离心机(sigma公司), Aglient手动进样器(Agilent公司)，FA1004电子天平。

1.2 对照品

藁本内酯(中国药品生物制品检定所，批号111737-201102)；正丁基苯酞(成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-12121201)。

1.3 试剂

乙酸乙酯色谱纯(Metedia)。

1.4 样品来源

1号辽藁本样品：辽宁省清源县药材种植基地；2号辽藁本样品：辽宁省沈阳市；3号辽藁本样品：辽宁省凤城县，以上样品经鉴定为辽藁本。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液配制

精密称取藁本内酯对照品17.12 mg置于5 ml量瓶中，乙酸乙酯溶解、定容，得到3.424 mg·ml-1对照品母液，精密称取正丁基苯酞对照品18.45 mg，置于5 ml量瓶中，乙酸乙酯溶解、定容，得到3.69 mg·ml-1对照品母液，从中精密吸取1 ml,置于10 ml量瓶中，乙酸乙酯定容，得到0.396 mg·ml-1对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液适量，配置一系列浓度的混合对照品。对照品母液保存于-20 ℃冰箱中，混合对照品溶液保存于-4 ℃冰箱中。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取辽藁本细粉约0.3 g置于具塞锥形瓶中，精密加入乙酸乙酯20 ml称重，超声30 min,乙酸乙酯补足减失质量，摇匀后10000 r·min-1离心5 min,取上清即得，供试品保存于-4 ℃冰箱中。

2.3 气相色谱条件

图1显示， HP-5MS气相色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm Aglient公司)，分流不分流进样口:温度250 ℃，FID检测器:温度300 ℃，H2：40 mL·min-1,空气400 mL·min-1,流速1 mL·min-1,分流比10∶1，程序升温条件：50 ℃，10 ℃·min-1至94 ℃，2 ℃·min-1至102 ℃， 5 ℃·min-1至130 ℃，2 ℃·min-1至144 ℃，0.5 ℃·min-1至145.5 ℃， 0.2 ℃·min-1至146.8 ℃，后运行5 min至280 ℃。

图1 辽藁本气相色谱图注：1.正丁基苯酞；2.藳本内酯

2.4 标准曲线制备

图2、3显示，分别精密吸取上述对照品母液，配制不同浓度混合对照品溶液，精密吸取1-6号混合对照溶液1 μL注入气相色谱仪，记录峰面积，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。计算回归方程：藁本内酯回归方程Y=1510.3X-112.39，在 85.6～684.8μg·ml-1范围内线性关系良好，r=0.9990；正丁基苯酞回归方程Y=243.44X-8.5373，在 46.13～738μg·ml-1范围内线性关系良好，r=0.9994。

图2 藁本内酯对照品标准曲线图

图3 正丁基苯酞对照品标准曲线图

2.5 精密度考察

分别精密吸取线性测定项下的3号混合对照品溶液1 μL，重复进样6次，测定峰面积，计算相对标准偏差。藁本内酯、正丁基苯酞精密度RSD%分别为0.97%、0.84%，该方法精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液1 μL，分别于0、0.5、1、2、4、8 h测定其峰面积，考察溶液的稳定性，计算相对标准偏差，藁本内酯、正丁基苯酞8 h稳定性RSD%分别为1.97%、1.44%，该方法8 h内稳定性良好。

2.7 重复性

表1显示，精密称取辽藁本细粉约0.3 g共6份，置于具塞锥形瓶中，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取1 μL注入气相色谱仪，测定峰面积，计算相对标准偏差。藁本内酯、正丁基苯酞重复性RSD%分别为1.57%、1.32%，该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知藁本内酯、正丁基苯酞含量的样品共6份，置于具塞锥形瓶中，精密加入藁本内酯、正丁基苯酞对照品适量，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取上述溶液1 μL注入气相色谱仪，测定峰面积计算回收率。藁本内酯平均回收率101.34%，RSD%1.87%，正丁基苯酞平均加样回收率98.45%，RSD%1.62%，该方法加样回收率合格。

2.9 样品的含量测定

表1显示，取辽藁本药材细粉3批，分别精密称取约0.3 g(n=2)，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密量取1 μL 注入气相色谱仪，同时精密吸取3号混合对照品溶液1 μL注入气相色谱仪，计算测定3批样品含量。

表1 藁本内酯、正丁基苯酞加样回收率

表2 3批辽藁本样品含量测定结果

3 讨论

辽藁本中含有大量挥发性成分，为其主要有效成分，其中含有的藁本内酯为苯酞类成分，具有一定镇痛作用，对急慢性炎症有明显抑制作用[2]，能通过激动PPARγ抑制TLR4/NF-kB信号通路的活化从而发挥抗炎作用[3]，能够抑制LPS诱导的小鼠体内外炎症反应[4]，能够保护OGD-R损伤的人脐静脉内皮血管细胞，抑制细胞氧化损伤，调节内皮功能[5]。正丁基苯酞是辽藁本抗炎有效成分之一，能够抑制缺血后组织花生四烯酸和磷脂酶A2基因的表达[6]，降低炎症区域肿瘤坏死因子和细胞间黏附因子的表达[7]，诱导海马CA1区HSP70的表达而发挥对脑缺血/再灌注损伤神经元的保护作用[8]，对LPS刺激后的小胶质细胞，能够抑制NO的释放，提高神经元存活率[9]。脑梗死后给予正丁基苯酞进行干预，可以改善神经功能行为学评分，上调shh/Ptch1/Glil和BDNF表达水平，对脑缺血后脑组织神经可塑性具有保护作用[10]。故本研究采用气相色谱法，建立辽藁本中有效成分藁本内酯、正丁基苯酞含量测定方法，为辽藁本质量标准建立提供依据。

本研究同时测定辽藁本药材中藁本内酯、正丁基苯酞含量，其方法简便，操作性好，为辽藁本的质量控制提供了一种新的方法。在色谱条件的确定过程中，考察过HP-5MS、HP-225、DB-17等多种不同极性气相色谱柱，根据最终分离效果采用HP-5MS进行分离。在本实验程序升温条件下，辽藁本中成分多数可以达到基线分离，可进行进一步指纹图谱研究。

文献报道，藁本内酯稳定性较差，常温保存易发生多种异构化，纯品在-20 ℃可长时间保存，溶于氯仿-20 ℃保存比较稳定，溶于乙醇30 d降解较多[11]。故本研究根据藁本内酯这一特性，对照品母液保存于-20 ℃冰箱中，混合对照品和供试品每日重新制备，-4 ℃保存。稳定性考察仅考察8 h，每日实验均在8 h内完成。

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