郭国贤，张秀芹，苗 翠，侯广正，徐丽佳

（辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，沈阳 110016）

酶联免疫试剂盒（ELISA）作为一种测定兽药残留的重要手段，是以免疫学反应为根底的。其基本原理是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，显色后用酶标仪在固定波长下读出吸光度值。由于酶的催化效率很高，间接放大了免疫反应的结果，使测定方法达到较高敏感度[1]。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。所以ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、仪器化程度低、检测速度快、样本前处理简单、价格低和适于开发成携带方便等优点，已成为我国兽药残留检测现场监控、大量样本筛查的主要方法[2]。

目前，酶联免疫试剂盒技术发展迅猛，用于兽药残留筛查的试剂盒品种几乎涵盖日常监控的所有品种，但试剂盒的产品质量参差不齐，市场准入门槛低、监管相对匮乏，导致现在市面上试剂盒厂家繁多，质量参差不齐，且目前也没有一种系统的评价方法对其进行评价，部分产品与同类产品竞争中过分追求价格取胜，而不重视产品质量。为了能够客观、公正地对其质量进行评价，参考农医发[2005]17号文中的评价标准。本文对辽宁省市面上销售的多家试剂盒厂家的多个品种进行了对比，简单介绍试剂盒对比实验的总体思路，以及在实验和日常使用过程中所遇到的一些问题。

1 试剂盒对比实验

1.1 试剂盒检测结果的准确性

检测结果的准确性主要是通过对实际样品的检测真假阳性的判断来决定的，作为一个初筛的手段，能够正确判断样品的阴阳性是试剂盒的最重要功能，使用同一品牌同一批号的试剂盒，根据统计学原理，重复测定20次有代表性的不同个体的空白样品，计算这些样品的平均值以及样本标准偏差，均值加上3倍样本标准偏差即为该试剂盒在本实验室的检出限，以此为判定依据，以不出现假阴性，假阳性控制在5%以内作为整体对比试验判分的基础[5]。未通过试验的试剂盒产品绝大多数都是出现了假阴性结果或者出现多个假阳性的结果。

假阴性或者假阳性的出现有多种原因，有人为的错误操作，例如移液枪使用不当造成的加样不准确、枪头产生气泡；试剂盒反应温度不够、反应时间不准确；试剂盒未彻底回温等。也有试剂盒产品的质量问题，例如试剂盒内标准品不准确、抗原抗体包被不均匀等。其中有一个容易疏忽的问题，就是在瘦肉精类盒子中适用基质的问题，瘦肉精类盒子根据适用的基质不同，分为组织类与动物尿液类，而常用的动物尿液的试剂盒又分为猪尿、牛尿等。试验发现某些试剂盒虽然标明适用基质为动物尿液，但实际应用中发现牛尿的假阳性率过高，因为不同动物的尿液以及不同地域的样品都存在着显著差异，这种情况在后期使用过程中也同时出现了。后来试剂盒厂家针对自己的产品，纷纷做出相应的调整，有些厂家将适用基质由原来的动物尿液改为适用于猪尿，而有些厂家则通过修改前处理方法，增加尿液的稀释步骤，来避免出现基质干扰。在后期的使用过程以及试剂盒比对试验中，就未出现大范围的假阳性率。因此，在选用试剂盒的时候一定要结合使用情况以及当地样本基质的特点来选用适宜的试剂盒。

1.2 试剂盒产品的精密度和准确度

试剂盒产品的准确度和精密度主要体现在测定平行样品的变异系数。在试剂盒对比试验中，用同一个实验人员测定同一厂家同一型号的3个不同批次的试剂盒，分别测定定量限、2倍定量限两种样品，每个试剂盒测定平行样品6次，用来计算每批试剂盒的3批的批内内变异系数和批间变异系数[4]。由于ELISA试剂盒是以免疫学反应为根底的，所以抗原包被不均一、抗原与抗体结合不稳定、底物显色不彻底、生产工艺等因素都会影响试剂盒产品的稳定性。使用同一个熟练操作的实验人员测定同一厂家同一品种的3批次试剂盒，来尽量排除人为因素的影响，最后得出的分值就可以看出试剂盒产品的准确度与精密度。从对比试验的结果来看，结果较好的试剂盒该部分得分总体较高，也就是说该项评价总体与试剂盒的质量成正比。

1.3 检测结果的回收率

一些试剂盒回收率不稳定，参与实验的试剂盒最低的回收率有16.8%，最高的有817.8%，虽然在判定结果是以实验室实际计算出的检出限为计，但回收率如果过高或者过低还是会影响结果的准确性。过高的回收率不排除某些厂家为了避免假阴性结果的出现而调高反应率，而回收率过低，则可能与试剂盒所提供的样本提取液、抗原、抗体、酶结合物、底物等因素有关。虽然该项不是决定性指标，但根据近些年的数据来看，结果较好的试剂盒回收率通常较好而且比较稳定。

2 试剂盒使用过程中发现的问题

2.1 试剂盒产品的检出限设定不科学

在日常使用过程中，发现有些试剂盒的检出限设定的很低，甚至远低于自身产品的检测能力。检出限定低了，假阳性势必会增加。为了突出自身产品的性能，使其在竞争中能够脱颖而出，有些厂家故意压低检出限，甚至超出自身产品所能达到的能力范围。对于某一具体药物和具体样本来说，并非试剂盒检出限越低越好，理想状态是试剂盒检测范围，也就是标准曲线范围的中间值与该药物在某一样本的“超标值”或“阳性值”近，这样既可以减少误差，又方便用户对结果进行判定[1]。所以，在日常选用试剂盒的过程中，并不是检出限越低试剂盒就越好，而是结合样本的“超标值”或“阳性值”以及试剂盒的曲线范围来选取最适宜的试剂盒。而厂家在设定产品的检出限时，也应结合样本的“超标值”或“阳性值”以及自身产品能力来设定适宜的检出限。

2.2 样品前处理过程中发现的问题

对于硝基呋喃类药物残留的测定，因为硝基呋喃类抗生素对光敏感，具有代谢快速的特点，在动物体内的半衰期仅为几小时，在检测硝基呋喃类药物残留检测时，通常不易检出原药残留。例如呋喃唑酮在停药后12 h内从组织中消失，而其代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）在动物体内则以组织蛋白结合物的形式存在，在体内可残留数轴。因此当原药浓度将至检测限以下时，一般检测其在体内的代谢物，所以需对其进行衍生[5]。在试剂盒测试过程中发现，有些厂家在说明书中标明了两种衍生的方式，一种是室温衍生16 h，一种是60℃衍生1.5 h的快速衍生。实际操作发现，使用快速衍生的检测结果不如使用16 h室温衍生的检测结果稳定。虽然高温衍生用时短，但考虑到实验室自身条件以及结果，室温16 h的衍生方法还是相对稳定的。

2.3 日常使用过程中应注意的细节

试剂盒储存及反应温度的控制：试剂盒的储存一般都存放在冷藏室（2～8℃），如果温度过低，可能会导致酶失活。在使用前，一定要回温，特别是微孔板、洗涤液、标准品、复溶液等盒内材料与试剂，应在使用前取出并按说明书操作回温[6]。在使用过程中，也应注意实验室温度，一般来说应控制在25℃，如室温达不到要求，则在试剂盒反应过程中，应放置在25℃烘箱中进行。温度过低，试剂盒可能会出现显色不彻底，而温度过高，显色过深同样影响测定结果的准确性。

试剂盒使用过程中移液器应注意的细节：在移液器的使用过程中，应该注意以下细节：加样过程中应避免移液枪枪头出现气泡，在使用单枪进行加样的时候，尽量选取吸一打二的方式，使用排枪的时候，应尽量使用吸二打一的方式来避免出现加样量不准确的情况。同时在加样过程中，枪头不能触碰反应孔壁。

在将液体加入酶标孔中后，应将酶标板放置在平整的桌子上，轻微震荡，使孔内液体充分混匀。在反应过程中，要盖好盖板膜，提供避光环境，并且防止孔内液体挥发。

在洗板过程中，每次加入洗液时应轻微震荡，并且放置约20 s，并且在倾倒孔内液体的过程中，应避免出现其中一个酶标孔内的液体流入另一酶标孔中造成的交叉污染。洗板完毕后，应注意观察反应孔中是否含有气泡，如含有气泡，应用干净的移液枪头将气泡挑去，但在挑气泡的过程中，不能触碰孔壁及孔底。

因为酶联免疫试剂盒的终止液一般为2 mol·L-1的盐酸，具有较强的腐蚀性，所以在加入终止液时，应注意终止液不能接触皮肤以及衣物，如不小心接触皮肤，应及时用大量清水冲洗。

在配置样本提取液、稀释液、洗液等试剂盒不提供的液体时，如需配置水溶液的话，必须使用去离子水。因为自来水或者矿物质水中可能含有能干扰酶标板测定的金属离子以及矿物质盐类。

酶联免疫试剂盒是通过最终使用酶标仪读取吸光度值来进行测定的，所以在使用酶标仪读数前，应提前打开酶标仪，使酶标仪内灯预热＞30 min，使酶标仪状态稳定[7]。

3 小结

近年来，酶联免疫试剂盒发展迅速，试剂盒的质量、操作便利程度等均在稳步提升，但由于地区差异、样品差异及试剂盒厂家种类繁多，所以在选用试剂盒的时候，还是建议对试剂盒的适用基质、准确性、稳定性、检出限等关键参数进行考察，以避免出现假阳性或者假阴性的现象发生。