黄 滔，曹玉祥，张志坚，周兴路，魏慧君，吴志浩

(1.皖南医学院 临床医学院，安徽 芜湖 241002；2.安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000；3.天津医科大学总医院 肺癌研究所，天津 300052；4.皖南医学院 检验学院，安徽 芜湖 241002；5.皖南医学院 活性生物大分子研究重点实验室，安徽 芜湖 241002；6.皖南医学院 基础医学院，安徽 芜湖 241002)

DNA甲基化是哺乳动物基因组中最常见的表观遗传修饰，主要由DNA甲基转移酶的催化来实现[1]。DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)是人体内存在的最重要的甲基转移酶，起着维持甲基化的作用[2]。DNMT1是DNMTs的一个重要亚型，编码1495个氨基酸，其羟基端是保守的催化甲基化反应结合域。DNMT1在多种肿瘤细胞中高表达，如白血病[3]、非小细胞肺癌[4]、子宫内膜癌[5]等，与肿瘤的发生、发展、耐药和预后有着紧密联系，可被选作肿瘤去甲基化治疗的靶点[6]。目前关于调控DNMT1的分子机制和生物学意义的研究较少，因此克隆DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体为深入研究其调控机制和生物学意义奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM 培养基 (HyClone 公司);pGL3-Basic 质粒、质粒小量提取试剂盒 (Promega公司);Polyjet (恩博生物公司);限制性核酸内切酶XhoⅠ和KpnⅠ (NEW ENGLAND BioLabs公司);T4 DNA连接酶 (TaKaRa 公司);细胞基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)；E.coli DH5α Competent Cells (TaKaRa公司);PCR产物纯化试剂盒(天根公司产品)，A549细胞和H1299细胞为实验室冻存。

1.2 方法

1.2.1 细胞基因组DNA的提取 由实验室冻存的A549细胞复苏后，利用细胞基因组DNA提取试剂盒提取A549基因组DNA，利用分光光度计检测器检测提取DNA的浓度，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和完整度。

1.2.2 DNMT1基因启动子克隆 在UCSC Genome Browser网站上查找出DNMT1基因启动子序列，根据序列利用Oligo 7设计出上游和下游引物，加上KpnⅠ和XhoⅠ 酶切位点和保护碱基。上游引物：5′-GGGGTACCTGCTGTCATATCCAAGAAATCATTGCC-3′(下划线为KpnⅠ酶切位点)，下游引物：5′-TTTCTCGAGGATGTACCAAACGGAGAGAGGCGATAC-3′(下划线为XhoⅠ酶切位点)，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。启动子PCR扩增反应条件为预变性94℃ 3 min，变性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 2 min，延伸72℃ 5 min，共30循环，10℃保温。

1.2.3 荧光素酶报告基因载体的构建 用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ对PCR纯化产物和pGL3-Basic质粒进行酶切20 h和5 h，酶切完成后用纯化试剂盒进行纯化，分别测出其浓度，按启动子片段：pGL3-Basic 载体为3∶1的摩尔比进行连接，用T4 DNA连接酶连接5 h。将30 μL的连接产物转化到100 μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并经含Ampicillin 的LB固体培养基培养，挑出10个单菌落，进行菌落PCR，筛选出1个阳性菌落，再经过含Ampicillin 的LB液体培养基培养过夜，用质粒小提试剂盒进行质粒提取后，酶切鉴定和测序鉴定。

1.2.4 启动子活性检测 将生长状态良好的H1299细胞均匀接种于细胞培养12孔板中，当细胞数量达70%左右时将pGL3-proDNMT1-luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc进行共转，设立一个pGL3-Basic 质粒空白对照，转染48 h后饥饿过夜收样后利用双荧光检测试剂盒检测萤火虫和海肾荧光素酶活性。每组设立3个复孔，实验重复3次。

1.2.5 统计学分析 采用t检验进行统计学分析，P<0.05说明差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DNMT1启动子目的片段的PCR扩增 用提取出来的人非小细胞肺癌A549基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳，结果显示与设计的启动子目的片段长度一致，并呈现出一条特异性条带(图1)。

图1 DNMT1启动子PCR产物琼脂糖电泳图

2.2 DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体的菌落PCR鉴定 将大量扩增出的片段进行纯化，将纯化后的产物和pGL3-Basic质粒分别行双酶切、连接、转化。选取单个菌落进行菌落PCR扩增出片段长度与设计的长度一致，初步鉴定了DNMT1启动子荧光素酶报告基因重组质粒的构建成功(图2)。

图2 DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体的菌落PCR鉴定图

2.3 DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体的双酶切鉴定 将挑出的阳性单个菌落经过液体LB培养基培养过夜后提取质粒，用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ进行双酶切，用1%的琼脂糖凝胶将酶切产物进行电泳。结果显示共出现2条带，4818 bp出现的为载体片段，1643 bp出现的为目的片段。说明目的片段在载体上插入成功(图3)。

图3 重组质粒酶切后琼脂糖胶电泳图

2.4 DNMT1启动子荧光素酶报告基因活性检测 在12孔板中接种H1299细胞，以pGL3-Basic质粒作为对照，转染pGL3-proDNMT1-luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc，收样后用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果显示转染pGL3 -proDNMT1-luc的实验组与转染pGL3-Basic-luc的对照组相比荧光量升高，对照组(0.1533±0.00548)和实验组(2.850±0.06481)相比差异有统计学意义(t=41.46，P=0.0006)，因此可见构建的DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体具有启动子活性(图4)。

图4 DNMT1启动子活性检测

3 讨论

报告基因是研究基因表达调控和基因工程的重要手段之一，其中双荧光素酶报告基因应用较广泛。荧光素酶的表达量与荧光的强度相关，可作为真核细胞中基因表达量及启动子活性的测定手段，其中常用的报告基因载体为pGL3-Basic 载体[7]。

哺乳动物的基因组甲基化主要由5个DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT2、DNMT3A/3B和DNMTL)催化。其中DNMT1甲基化DNA复制后产生的半甲基化位点，使特定的表观遗传标记得以维持。据相关文献报道,DNMT1与细胞的增殖和恶性转化以及肿瘤细胞的存活有着密切关系。DNMT1还具有调节细胞周期和肿瘤抑制基因的能力，以及通过p21和p53的高甲基化引发肺干细胞的增殖[8-10]。另外，DNMT1与基因启动子结合后可调节下游途径，如wnt/β-catenin。同时，DNMT1还影响胚胎干细胞和体细胞中的微卫星的稳定性[11-12]。我们通过DNMT1启动子克隆、酶切、连接、转化等步骤构建的荧光素酶报告基因载体，对深入研究DNMT1 的分子机制和DNMT1在肿瘤细胞中的作用及其相关机制有着重要作用；同时，对相应的靶向药物的开发和提高临床疗效具有重要的临床意义。

[1] BENETATOS L,VARTHOLOMATOS G.On the potential role of DNMT1 in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes:not another mutated epigenetic driver[J].Annals of hematology，2016,95(10):1571-1582.

[2] BOLAND MJ,CHRISTMAN JK.Characterization of Dnmt3b:thymine-DNA glycosylase interaction and stimulation of thymine glycosylase-mediated repair by DNA methyltransferase(s) and RNA[J].Journal of molecular biology，2008,379(3):492-504.

[3] KLISOVIC RB,STOCK W,CATALAND S,etal.A phase I biological study of MG98,an oligodeoxynucleotide antisense to DNA methyltransferase 1,in patients with high-risk myelodysplasia and acute myeloid leukemia[J].Clinical cancer research，2008,14(8):2444-2449.

[4] XING J,STEWART DJ,GU J,etal.Expression of methylation-related genes is associated with overall survival in patients with non-small cell lung cancer[J].British journal of cancer，2008,98(10):1716-1722.

[5] LIAO X,SIU MK,CHAN KY,etal.Hypermethylation of RAS effector related genes and DNA methyltransferase 1 expression in endometrial carcinogenesis[J].International journal of cancer，2008,123(2):296-302.

[6] JUNG Y,PARK J,KIM TY,etal.Potential advantages of DNA methyltransferase 1 (DNMT1)-targeted inhibition for cancer therapy[J].Journal of molecular medicine (Berlin,Germany)，2007,85(10):1137-1148.

[7] NASEER S,KHAN S,林佳,等.C_3启动子克隆及荧光素酶报告基因载体构建[J].高师理科学刊，2016(11):41-44.

[8] MUDBHARY R,HOSHIDA Y,CHERNYAVSKAYA Y,etal. UHRF1 overexpression drives DNA hypomethylation and hepatocellular carcinoma[J].Cancer cell，2014,25(2):196-209.

[9] PENG L,YUAN Z,LING H,etal.SIRT1 deacetylates the DNA methyltransferase 1 (DNMT1) protein and alters its activities[J].Molecular and cellular biology，2011,31(23):4720-4734.

[10] LIU CC,LIN JH,TW HSU,etal.IL-6 enriched lung cancer stem-like cell population by inhibition of cell cycle regulators via DNMT1 upregulation[J].International journal of cancer，2015,136(3):547-559.

[11] ESPADA J,PEINADO H,LOPEZ-SERRA L.Regulation of SNAIL1 and E-cadherin function by DNMT1 in a DNA methylation-independent context[J].Nucleic acids research，2011,39(21):9194-9205.

[12] HA K,LEE GE,PALII SS,etal.Rapid and transient recruitment of DNMT1 to DNA double-strand breaks is mediated by its interaction with multiple components of the DNA damage response machinery[J].Human molecular genetics，2011,20(1):126-140.