吴清华，魏担，梁颖，裴瑾，陈江，刘薇

桃仁为蔷薇科植物桃Amygdaluspersica(L.)Batsch或山桃Amygdalusdavidiana(Carr.) Franch.的干燥成熟种子，味甘、苦，性平，归心、肝、大肠经，有小毒，具有活血祛瘀，润肠通便、止咳平喘的功效[1]，是常用活血化瘀中药。桃仁的主要化学成分有脂质(如中性脂、糖脂质、磷脂)、苷类(苦杏仁苷、野樱苷)、糖类(葡萄糖、蔗糖等)、蛋白质、尿囊素酶等[2]。近年来，桃仁油即桃仁脂溶性成分的研究逐渐受到重视，药材中的桃仁油含量为30～60%。采用GC-MS法对桃仁油分析表明，油中主要含有油酸（oleic acid）、亚油酸(linoleic acid)、棕榈酸(n-hexadecanoic acid)、硬脂酸(octadecanoic acid)、苯甲醛(benzaldehyde)等化学成分[3]。桃仁、山桃仁化学成分研究较多，以脂肪酸、苦杏仁苷含量为评价指标，两者无明显差异[4]。光桃仁作为市场上的主流品种之一，其化学成分研究暂无报道。安全、方便、快捷大规模提取桃仁油的方法亦无报道。桃仁油中油酸、亚油酸、棕榈酸的含量测定方法较多，其样品需进行甲酯化处理或直接测定其相对质量分数[4～6]，而其他成分的含量未见报道。

角鲨烯是一种高度不饱和烃类化合物，于1906年在黑鲨鱼肝油中分离得到，具有增强体质、抗疲劳、抗肿瘤等作用，在功能性食品中广泛应用。角鲨烯在动物油脂中以鲨鱼肝油含量最高，植物油中角鲨烯的皂化物较多，只有橄榄油和米糠油含量较多，目前提取角鲨烯通常采用富含此组分的大鲨鱼肝为原料[7]。β-谷甾醇亦具有降脂、抗癌、抗炎、抗氧化等作用。故选择β-谷甾醇和角鲨烯为桃仁指标性成分，对桃仁药材及桃仁油中β-谷甾醇、角鲨烯采用高效液相色谱法进行定量分析并建立桃仁油的质量评价方法。

1 仪器与材料

HH-S24S数显恒温水浴锅(上海君竺仪器制造有限公司)；SHB-3型循环水多用真空泵(郑州杜甫仪器厂)；SENCO R-210型旋转蒸发器(上海申顺生物科技有限公司)；Agilent1200型高效液相色谱仪；DAD二极管阵列检测器；Agilent Chemstation色谱工作站。

家桃仁、山桃仁、光桃仁（产地、购买地见表1），经裴瑾教授鉴定分别为蔷薇科植物桃Amygdaluspersica(L.) Batsch、山桃Amygdalusdavidiana(Carr.) Franch.和光核桃(西藏桃)Amygdalusmira(Koehne) Yü et Lu 的干燥成熟种子；山桃仁压榨油；β-谷甾醇(由四川维克生物科技有限公司提供，HPLC≥99%)；角鲨烯(由中国药品生物制品检定所提供，HPLC≥99%，批号：140721-200601)；自制重蒸水；甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 β-谷甾醇和角鲨烯HPLC含量测定

2.1.1 色谱条件的考察 通过对色谱条件系统性的考察，确定以下色谱条件最佳。色谱柱：迪马C18柱（4.6mm×150mm，5μm）、迪马C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇∶乙腈∶水(43∶55∶2)，流速1.0mL/min，检测波长210nm，柱温35℃，进样量5μL，考察结果见表1。

表1 色谱条件考察结果表

图1 β-谷甾醇、角鲨烯含量分析色谱条件考察

图2 β-谷甾醇、角鲨烯含量分析色谱条件考察

图3 β-谷甾醇、角鲨烯含量分析色谱条件考察

图4 β-谷甾醇、角鲨烯含量分析色谱条件考察

图5 β-谷甾醇、角鲨烯含量分析色谱条件考察

图6 β-谷甾醇、角鲨烯含量分析色谱条件考察

2.1.2 供试品溶液的制备 称取桃仁粉末(过四号筛)5g，置圆底烧瓶(已称重)中，加入50mL石油醚（60～90℃），80℃水浴回流60min，放冷，抽滤，取续滤液，50℃减压回收石油醚，称定重量，计算桃仁油得率；取桃仁油加乙腈、乙酸乙酯溶液（1∶2.5）溶解，并定容至10 mL，用0.45μm的微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 线性关系的考察 分别精密吸取一定量β-谷甾醇对照品溶液，加乙腈、乙酸乙酯溶液（1∶2.5）稀释至一定浓度，摇匀，备用。分别精密吸取各浓度对照品溶液5μL进样，测定峰面积。以峰面积为横坐标，β-谷甾醇浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得β-谷甾醇浓度(y)和峰面积(x)的相关回归方程：y=0.9633x+0.0969，R=0.9945，在0.518mg/mL～2.072mg/mL范围内线性关系良好。

分别精密吸取一定量角鲨烯对照品溶液，加乙腈、乙酸乙酯溶液（1∶2.5）稀释至一定浓度，摇匀，备用。分别精密吸取各浓度对照品溶液5μL进样，测定峰面积。以峰面积为横坐标，角鲨烯浓度为纵坐标，绘制标准曲线，得角鲨烯浓度(y)和峰面积(x)的相关回归方程：y=0.0834x-0.0211，R=0.9973，在0.033mg/mL～0.203mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 精密吸取一定浓度的β-谷甾醇和角鲨烯混合对照品溶液5μL，连续进样6次，测定其峰面积，计算RSD分别为0.35%、0.49%。

2.1.5 重复性试验 精密称定同一批次样品溶液6份，按照2.1.2制备样品溶液，进样5μL，测定β-谷甾醇和角鲨烯的峰面积，计算RSD分别为1.14%、1.72%。

2.1.6 稳定性试验 取同一样品溶液分别于0、2、6、12、24h进样5μL，测定β-谷甾醇和角鲨烯的峰面积，结果表明供试品溶液在24h内具有良好的稳定性。

2.1.7 加样回收试验 精密称定已知含量的样品6份，加入适量β-谷甾醇和角鲨烯对照品，按照2.1.2制备样品溶液，进样5μL，测定β-谷甾醇和角鲨烯的峰面积，计算平均加样回收率和RSD分别为98.24%、1.34%，99.01%、1.56%。2.1.8 样品中β-谷甾醇和角鲨烯的测定 以HPLC对18个批次不同品种、不同产地桃仁及桃仁油中β-谷甾醇和角鲨烯的含量进行测定，结果见图7、图8、表2。

图7 桃仁中β-谷甾醇和角鲨烯的含量测定色谱图

图8 桃仁、桃仁油中β-谷甾醇和角鲨烯的含量测定结果分析图

表2 桃仁、桃仁油中β-谷甾醇和角鲨烯的含量测定结果表

2.2 不同批次桃仁药材及桃仁油中β-谷甾醇和角鲨烯的含量

本实验对18个批次不同品种、不同产地的桃仁药材及桃仁油中β-谷甾醇和角鲨烯的含量进行了测定。18个批次药材样品中桃仁油的含量，无明显的种间差异，平均含量为46.85%；药材中β-谷甾醇和角鲨烯的含量亦无显著种间差异，桃仁、山桃仁与光桃仁中，β-谷甾醇的平均含量分别为0.090%、0.098%、0.097%，角鲨烯的平均含量分别为0.015%、0.014%、0.014%；但同一品种不同批次药材的含量差异较大。18个批次桃仁油中β-谷甾醇和角鲨烯的含量亦无显著种间差异，桃仁油、山桃仁油与光桃仁油中β-谷甾醇的平均含量分别为0.197%、0.198%、0.213%，角鲨烯的平均含量分别为0.032%、0.026%、0.030%。压榨法提取桃仁油与索氏回流提取桃仁油中角鲨烯含量基本一致，表明压榨法可有效提取桃仁中β-谷甾醇和角鲨烯。

2.3 桃仁药材含量测定方法的建立

根据以上实验结果建议：按桃仁干燥品计算，桃仁药材含桃仁油不得少于37%，β-谷甾醇不得少于0.07%，角鲨烯不得少于0.01%；桃仁油含β-谷甾醇不得少于0.16%，角鲨烯不得少于0.02%。

3 讨论

3.1 本研究结果表明，采用高效液相色谱法可有效测定桃仁药材及桃仁油中β-谷甾醇和角鲨烯的含量，其色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇∶乙腈∶水(43∶55∶2)为流动相，检测波长为210nm，流速1.0mL/min，柱温35℃，进样量5μL。同时，该色谱图中其他8个色谱峰的分离度亦较好，对其进行定性后，可对桃仁进行更全面的质量评价。

3.2脂溶性成分是种子类药材的一类主要有效组分，其定量分析主要采用气相色谱法。桃仁脂溶性成分的定量分析亦有报道，均采用气相色谱法，且样品需进行甲酯化处理或直接测相对质量分数。本实验采用高效液相色谱法同时测定桃仁药材中β-谷甾醇和角鲨烯的含量，方法简便，可作为桃仁质量评价方法之一，建立相应的质量标准。同时，该色谱图中其他8个色谱峰的分离度亦较好，对其进行定性后，可对桃仁进行更全面的质量评价。

3.3 本实验所用色谱条件检测时间较长，指标性成分色谱峰的保留时间均在44min后，采用多种方法进行试验，未得到有效地解决办法。该色谱条件下存在大量其他色谱峰，可结合其他分析方法进行定性分析，以更全面地评价桃仁药材及桃仁油的质量。通过对桃仁中脂溶性成分分析表明，桃仁油中含有大量的苯甲醛。苯甲醛为苦杏仁苷的水解产物之一，具有良好的抑菌和抗癌作用，也作食品添加剂使用。文献报道表明可采用高效液相色谱法对苯甲醛进行含量测定[8]。本实验对桃仁油中苯甲醛进行了定量分析，但由于苯甲醛在空气中易被氧化成苯甲酸，其样品溶液的制备存在一定难度，有待进一步的改进。

3.4 光桃仁基本作为山桃仁销售使用，约占山桃仁总量的50%左右。1989年以来，光桃仁的资源报道较多，其资源丰富；另外，生长条件、丰产栽培技术、SRAP-PCR研究亦有报道，但药理报道甚少，化学成分暂无报道。本研究对光桃仁脂溶性成分的含量、组成以及β-谷甾醇和角鲨烯的含量进行了分析，并与家桃仁、山桃仁进行比较分析，表明光桃仁与山桃仁差异较小，同时光桃仁资源丰富，可进行深入的开发利用研究，扩大其使用。