王庆军，马 丽，郝兆祥，罗 华，毕润霞，赵丽娜，侯乐峰，*

(1.枣庄市石榴研究中心，山东 枣庄 277300；2.枣庄学院，山东 枣庄 277160)

石榴(PunicagranatumL.)为石榴科石榴属落叶灌木或小乔木，原产伊朗、阿富汗等地，在长期传播和栽培过程中形成了许多的变异资源，极大地丰富了遗传多样性[1-2]。石榴分类通常依据花瓣数量、花朵颜色、结实性、果色等为品种形态特征，品种名称多以当地的习惯称谓命名，品种间的亲缘关系模糊不清，同物异名、同名异物的现象时常出现[3-4]。目前，不少学者已开始采用DNA分子标记等方法对石榴进行品种分类及亲缘关系探索，比如，张四普等[5]用SRAP标记对江苏等地23个石榴品种，苑兆和等[6]利用荧光AFLP标记技术对山东省25个石榴品种，赵丽华等[7-8]利用AFLP和ISSR标记技术对川滇等石榴品种进行了亲缘关系和遗传多样性分析，均表明中国多个产区的石榴都具有比较丰富的遗传多样性。Rania等[9]利用AFLP标记、Ghobadi等[10]利用ISSR标记、Noormohammadi等[11]采用RAPD、ISSR和SSR标记技术分析表明，突尼斯和伊朗石榴品种的遗传多样性更加丰富。这些研究为揭示石榴品种间亲缘关系及科学分类提供了非常有价值的信息，但它们的研究对象主要是食用石榴及少数赏食兼用的石榴资源，至今尚未见到专门针对观赏石榴品种的DNA分子标记研究。

观赏石榴(PunicaL.)是从普通石榴(PunicagranatumL.)中选出的观赏变种，具有花期长、花朵艳丽、花瓣姿色优美等多种特点，是园林绿化、庭院绿化、景区绿化最受欢迎的树种之一[12]。ISSR是一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记，它结合了RAPD和SSR的优点，具有成本低、使用方便和结果重现性较高等特点[13]。山东枣庄是中国著名的石榴产区之一，近年来选育和引进了大批观赏性石榴品种，本实验拟利用ISSR标记对35个不同形态的观赏石榴品种的遗传多样性与亲缘关系进行分析，以期为观赏石榴种质资源的分类、保存、有效利用和新品种选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试的35个观赏石榴品种采自“枣庄市石榴国家林木种质资源库”内(表1)。采集后用冰壶运回，于-70 ℃冰箱保存。

1.2 实验方法

1.2.1 石榴基因组DNA的提取与检测

参考Huang等[14]CTAB法从石榴幼叶中提取基因组DNA。用0.8%(m/V)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，用德国IMPLEN P300核酸蛋白超微量紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度，将DNA用TE稀释至终浓度为50 ng·μL-1，放入-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 引物筛选及ISSR- PCR扩增

ISSR随机引物中筛选多态性好，扩增稳定的多态性引物，选择品种间多态性好，谱带清晰，重复稳定的引物用于观赏石榴的遗传关系研究。用上海桑尼生物科技有限公司合成的8条ISSR随机引物(表2)对35个观赏石榴品种进行PCR扩增。2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA marker等试验药品采购于北京康为世纪生物科技有限公司，25 μL的PCR反应体系包含：ddH2O 10.5 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL 、10 μmol·L-1引物1 μL和50 ng·μL-1模板DNA 1 μL。PCR反应在美国BIO- RAD生产的梯度PCR仪(C1000)进行扩增。扩增程序为：预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，45 s，退火(Tm-5) ℃，30 s(Tm见表2)，延伸72 ℃，2 min，35个循环；再延伸72 ℃，10 min；最后4 ℃保存，PCR扩增产物拍照保存。

1.2.3 数据处理

通过Alphaview SA软件对电泳结果读取谱带分子量，以DL2000 DNA Marker谱带分子量为标准，由软件分析得到各条谱带分子量的大小。电泳图谱中每一个条带均代表了ISSR引物与石榴模板DNA互补结合的位点，同一引物在相同迁移率位置谱带清晰可辨的记为“1”，模糊或缺失的记为“0”[15]。统计所有ISSR引物扩增的结果，建立“0，1”原始矩阵。采用POPGENE1.32 软件，在假定种群处于Hardy- Weinberg 平衡状态下进行遗传参数分析，分别计算多态位点比率(PPB)、平均Shannon信息多样性指数(I)、平均Nei’s遗传多样性指数(He)、平均观察等位基因数(Na)和平均有效等位基因数(Ne)。用NTSYS2.10软件计算35个品种间的遗传相似系数(GS)，根据GS值按以不加权成对群算术平均法(UPGMA)构建35个品种的亲缘关系聚类图。

表1供试观赏石榴品种的编号、名称、来源及特性

Table1The codes，names，origins and characters of tested ornamental pomegranate cultivars

编号Code名称Name产地Origin花色Flowercolor花型Flowerform果皮颜色Pericarpcolor1峄城青皮月季Yichengqingpiyueji山东Shandong红色Red单瓣Single青绿色Cyan-green2峄城重瓣粉红月季Yichengchongbanfenhongyueji山东Shandong粉色Pink重瓣Double白色White3峄城重瓣粉红白皮甜Yichengchongbanfenhongbaipitian山东Shandong粉色Pink重瓣Double白色White4峄城红皮月季(大果)Yichenghongpiyueji(daguo)山东Shandong红色Red单瓣Single红色Red5峄城重瓣红月季Yichengchongbanhongyueji山东Shandong红色Red重瓣Double未结果Nofruit6峄城单瓣粉红白皮酸Yichengdanbanfenhongbaipisuan山东Shandong粉色Pink单瓣Single白色White7峄城红皮月季(小果)Yichenghongpiyueji(xiaoguo)山东Shandong红色Red单瓣Single红色Red8峄城单瓣玛瑙Yichengdanbanmanao山东Shandong玛瑙色Agatecolor单瓣Single未结果Nofruit9峄城红牡丹石榴Yichenghongmudan山东Shandong红色Red重瓣Double红色Red10峄城重瓣白皮酸Yichengchongbanbaipisuan山东Shandong白色White重瓣Double白色White11峄城小红牡丹Yichengxiaohongmudan山东Shandong红色Red重瓣Double青绿色Cyan-green12峄城抗寒砧木1号Yichengkanghanzhenmu1山东Shandong红色Red单瓣Single红色Red13峄城重瓣白花酸Yichengchongbanbaihuasuan山东Shandong白色White重瓣Double白色White14超青Yichengchaoqing山东Shandong红色Red单瓣Single青绿色Cyan-green15峄城重瓣红皮酸Yichengchongbanhongpisuan山东Shandong红色Red重瓣Double红色Red16峄城单瓣粉红青皮酸Yichengdanbanfenhongsuan山东Shandong粉色Pink单瓣Single青绿色Cyan-green17峄城红花重瓣紫皮酸Yichenghonghuachongbanzipisuan山东Shandong红色Red重瓣Double紫红色Purplishred18峄城红花重瓣青皮酸Yichenghonghuachongbanqingpi-suan山东Shandong红色Red重瓣Double青绿色Cyan-green19峄城粉红重瓣白皮甜Yichengfenhongchongbanbaipitian山东Shandong粉色Pink重瓣Double白色White20峄城玛瑙石榴Yichengmanao山东Shandong玛瑙色Agatecolor重瓣Double红色Red21宁津单瓣玛瑙Ningjindanbanmanao山东Shandong玛瑙色Agatecolor单瓣Single未结果Nofruit22宁津红皮酸Ningjinhongpisuan山东Shandong红色Red单瓣Single红色Red23泰山红牡丹Taishanhongmudan山东Shandong红色Red重瓣Double红色Red24白珍珠Baizhenzhu山东Shandong白色White单瓣Single白色White25墨石榴Moshiliu山东Shandong红色Red单瓣Single紫红色Purplishred26月季石榴Yuejishiliu山东Shandong红色Red单瓣Single红色Red27日本看石榴JapanKanshiliu山东Shandong红色Red单瓣Single红色Red28绣球牡丹Xiuqiumudan山东Shandong红色Red重瓣Double红色Red29皖黑1号Wanhei1安徽Anhui红色Red单瓣Single紫红色Purplishred30邳州重瓣三白甜Pizhouchongbansanbaitian江苏Jiangsu白色White重瓣Double白色White31美国玛瑙AmericaManao美国America玛瑙色Agatecolor重瓣Double未结果Nofruit32喜爱Xiai美国America红色Red单瓣Single红色Red33美国粉红重瓣AmericaFenhongchongban美国America粉色Pink重瓣Double红色Red34Ambrosia美国America红色Red单瓣Single未结果Nofruit35玲珑牡丹Linglongmudan陕西Shaanxi红色Red重瓣Double未结果Nofruit

表2ISSR- PCR扩增的引物及扩增结果

Table2ISSR primers used for ISSR- PCR amplification and their amplification results

引物名称Primername序列Sequence(5'-3')退火温度Tm/℃扩增谱带数Numberofbands多态性谱带数Numberofpolymorphicbands多态性比率Ratioofpolymor-phisms/%UBC808(AG)8C52212095.24UBC809(AG)8G52222195.45UBC841(GA)8YC53242395.83UBC811(GA)8C52232086.96UBC842(GA)8YG53201995.00UBC816(CA)8T501616100.00UBC835(AG)8YC53242291.67UBC827(AC)8G52181794.44总计Total168158平均Average2119.7594.05

2 结果与分析

2.1 ISSR- PCR引物扩增多态性结果

筛选出的8条引物(表2)在35个观赏石榴品种中共检测到168个DNA位点，平均每条引物扩增出21个DNA位点，其中有158个多态性位点，多态性位点比率(PPB)为94.05%。8条ISSR引物扩增的DNA位点数(表2)在16～24个，多态性位点比率在86.96%～100%，其中8条引物在35个品种中多态性比率表现最低为引物UBC811是86.96%，而UBC816扩增出的DNA位点为16，位点数最少，但多态性位点比率最高，达100%。表明8条引物具有较好的多态性，35个石榴品种的遗传多样性比较丰富。每条引物扩增平均产生21个DNA位点和19.75个多态性位点，扩增产生的DNA片段长度在101～2 000 bp。结果表明，采用不同的ISSR引物对观赏石榴品种进行PCR扩增，扩增出的位点数差异较大，但多态性位点的比例差异不大(表2)。

2.2 观赏石榴品种的遗传多样性分析

通过Popgene1.32软件对35个观赏石榴品种的遗传多样性参数进行统计分析，结果表明平均观察等位基因数(Na)为1.940 5，平均有效等位基因数(Ne)为1.678 5，平均Nei’s基因多样性指数(He)为0.379 9，平均Shannon信息指数(I)为0.553 0。结果表明，35个观赏石榴品种间的遗传变异较大，品种资源间存在比较丰富的遗传多样性。

M, DL 2 000 marker; 数字编号对应品种名称与表1相同。M, DL 2 000 marker; The number is the same as Table 1.图2 引物UBC835对35个品种的扩增结果Fig.2 Amplification result of 35 ornamental pomegranate cultivars using UBC835 primer

2.3 观赏石榴品种的遗传关系聚类分析

由8条引物对35个观赏石榴品种进行ISSR- PCR扩增获得的168个位点数据，计算品种间遗传相似系数，35个观赏石榴品种遗传相似系数在0.416 7～0.922 6。其中9号与26号遗传相似系数最小，说明这2个品种亲缘关系较远；28号与30号遗传相似系数最大，说明这2个品种亲缘关系最近。

利用NTSYS2.10软件，计算35个品种间的遗传相似系数(GS)，根据GS值构建35个品种的UPGMA亲缘关系聚类图(图3)。从图3可以看出，8条ISSR引物能将35个观赏石榴品种区分开。以遗传相似性系数(GS)0.668为阈值，供试的35个观赏石榴品种可分为6类：第Ⅰ类包含23个观赏石榴品种且分为2个亚类，第一亚类中包含22个观赏石榴品种且又分为2个小类，第一小类中包含12个石榴品种分别为1号、4号、7号、6号、5号、2号、9号、10号、3号、8号、12号、15号，均来自山东，第二小类中包含10个观赏石榴品种分别为21号、25号、24号、27号、28号、30号、29号、33号、35号、34号；第二亚类中仅包含1个观赏石榴品种为32号，来自美国，具有花朵红色、花型单瓣、果皮红色等特性。第Ⅱ类仅包含1个观赏石榴品种为16号，来自山东，具有花朵粉色、花型单瓣、果皮青绿色等特性。第Ⅲ类包含6个观赏石榴品种且分为2个亚类，第一亚类中仅包含1个观赏石榴品种为13号，来自山东，具有花朵白色、花型重瓣、果皮白色等特性；第二亚类中包含5个观赏石榴品种且又分为2个小类，第一小类中仅包含1个观赏石榴品种为14号，来自山东，具有花朵红色、花型单瓣、果皮青绿色等特性，第二小类中包含的4个观赏石榴品种分别为17号、19号、18号、20号，均来自山东，且花型相同，均为重瓣。第Ⅳ类包含2个观赏石榴品种，分别是11号、26号，均来自山东，且花色相同，均为红色。第Ⅴ类仅包含1个观赏石榴品种为31号，来自美国，具有花朵玛瑙色、花型重瓣等特性。第Ⅵ类包含2个观赏石榴品种，分别是22号、23号，均来自山东，且花色、果色相同，均为红色。

1～35:品种名称与表1相同。The cultivar name of 1-35 is the same as Table 1.图3 35个观赏石榴品种的UPGMA亲缘关系聚类图Fig.3 The UPGMA genetic relationship clustering map of 35 ornamental pomegranate cultivars

3 讨论

用NTSYS2.10软件计算35个观赏石榴品种间遗传相似系数，从分子水平来说9号与26号遗传相似系数最小，表明品种的遗传分化越大，遗传多样性越高，遗传背景越复杂，亲缘关系较远，且物种存在历史长远[16]，但是两者均来自山东，且花色同为红色，表明与形态分类和按照地域分布分类的结果相差较远。28号与30号从分子角度看遗传相似系数最大，表明这两个观赏品种亲缘关系最近，28号来自山东，花色、果色均为红色、花型为重瓣，30号来自江苏花色、果色为白色、花型为重瓣，表明与形态分类和按照地域分布分类的结果不一致。利用UPGMA法构建分子树状图，以遗传相似性系数(GS)0.668为阈值，将35个石榴品种分为6个类群，31号、32号、33号、34号均来自美国，31号聚为第Ⅴ类，32号、33号、34号虽聚为第Ⅰ类但第Ⅰ类包含2个亚类，在第一亚类中33号、34号被聚为第二小类，32号被聚为第二亚类，这表明品种间亲缘关系与地理环境有一定相关性，但不是绝对性的，这与Maryam等[17]、Rania等[9]得出的突尼斯和伊朗石榴的聚类结果与地理分布划分结果不一致的研究结论基本相同。

巩雪梅[18]利用50个石榴品种材料进行资源遗传变异分子标记研究，表明不应当以花的重瓣、单瓣性状作为观赏石榴变种划分的依据。卢龙斗等[19]利用RAPD对55个石榴栽培品种进行分析，将55个石榴品种分为4个类群，分类结果与形态上的分类存在着一定的差异，即与根据花色和果味进行的分类没有相关性，而与按瓣型进行的分类有一定的相关性。本研究以遗传相似性系数(GS)0.668为阈值，供试的35个观赏石榴品种可分为6类，其中第Ⅰ类包含的23个观赏石榴品种中花色为红色且花型为单瓣的有1号、4号、7号、12号、25号、27号、29号和34号；花色为粉色且花型为重瓣的有2号、3号和33号，也说明不应当以花的花色和花型重瓣、单瓣性状作为观赏石榴变种划分的依据。

ISSR分子标记是从分子水平上对遗传物质差异的直接反映，而形态分类是从传统水平上对遗传物质差异的间接反映，且易受到环境作用的影响，因而应用ISSR标记技术对观赏石榴种质资源遗传多样性及亲缘关系研究分析，能更好地为观赏石榴种质资源保存、利用及品种改良等提供科学宝贵的依据[20]。建议在地域和表型特征的基础上结合多种分子标记技术等其他分类学方法，制定科学合理的分类体系，才能为观赏石榴品种的开发和利用尤其是品种选育杂交提供科学的依据。

[1] HASNAOUI N A， BUONAMICI F， SEBASTIANI M， et al. Development and characterization of SSR markers for pomegranate (PunicagranatumL.) using an enriched library[J].ConservationGeneticsResources，2010， 2(1):283-285.

[2] MOHAMMAD H S， MAJID T， BADRALDIN E S. Use of SRAP markers to assess genetic diversity and population structure of wild， cultivated， and ornamental pomegranates (PunicagranatumL.) in different regions of Iran[J].PlantSystematicsandEvolution，2012，298(6):1141-1149.

[3] 汪小飞， 周耘峰， 黄埔， 等. 石榴品种数量分类研究[J].中国农业科学，2010，43(5) :1093-1098.

WANG X F， ZHOU Y F， HUANG P， et al. Study on the classification on pomegranate cultivars by numerical taxonomy[J].ScientiaAgriculturaSinica， 2010， 43(5):1093-1098.(in Chinese with English abstract)

[4] 侯乐峰， 赵成金， 赵方坤， 等.山东峄城观赏石榴种质资源[J]. 中国果树，2009(3):59-60.

HOU L F, ZHAO C J, ZHAO F K, et al. Shandong Yicheng ornamental pomegranate germplasm resources[J].ChinaFruits, 2009(3): 59-60.(in Chinese with English abstract)

[5] 张四普， 汪良驹， 曹尚银， 等.23个石榴基因型遗传多样性的SRAP分析[J]. 果树学报，2008，25(5):655-660.

ZHANG S P， WANG L J， CAO S Y， et al. Analysis of genetic diversity of 23 pomegranate genotypes by SRAP[J].JournalofFruitScience， 2008， 25(5):655-660. (in Chinese with English abstract)

[6] 苑兆和， 尹燕雷， 朱丽琴，等.山东石榴品种遗传多样性与亲缘关系的荧光AFLP分析[J]. 园艺学报，2008，35(l):107-112.

YUAN Z H， YIN Y L，ZHU L Q， et al. Genetic diversity and relationshiP in pomegranate(PunciagarnautmL.)cultivarsin shandong revealed by fluorescent- AFLP markers[J].ActaHorticulturaeSinica， 2008， 35(l):107-112. (in Chinese with English abstract)

[7] 赵丽华， 李名扬， 王先磊. 川滇石榴品种遗传多样性及亲缘关系的AFLP分析[J]. 林业科学， 2010， 46(11): 168-173.

ZHAO L H， Li M Y， WANG X L. Genetic diversity and genetic relationship of pomegranate (Punicagranatum) in sichuan and yunnan evaluated by AFLP markers[J].ScientiaSilvaeSinicae， 2010， 46(11): 168-173. (in Chinese with English abstract)

[8] 赵丽华，李名扬，王先磊，等. 石榴种质资源遗传多样性及亲缘关系的ISSR分析[J]. 果树学报，2011，28(1):66-71.

ZHAO L H， Li M Y， WANG X L， et al. Genetic diversity and genetic relationship of pomegranate (Punicagranatum) germplasm evaluated by ISSR markers[J].JournalofFruitScience， 2011， 28(1):66-71. (in Chinese with English abstract)

[9] RANIA J， HASNAOUI N J， MARS M， et al. Characterization of Tunisian pomegranate (PunicagranatumL.) cultivars using amplified fragment length polymorphism analysis[J].ScientiaHorticulturae， 2008， 115(3):231-237.

[10] GHOBADI S， KHOUSHKHOUI M， TABATABAEI B E S. Phylogenetic relationships among some Iranian pomegranate accessions revealed by Inner simple sequence repeat (ISSR) markers[J].IranianJournalofHorticulturalScienceandTechnology， 2005，6(3):111-120.

[11] NOORMOHAMMADI Z， FASIHEE A， HOMAEE- RASHIDPOOR S， et al. Genetic variation among Iranian pomegranates (PunicagranatumL.) using RAPD， ISSR and SSR markers[J].AustralianJournalofCropScience， 2012， 6(2): 268-275.

[12] 曹尚银， 侯乐峰. 中国果树志石榴卷[M]. 北京: 中国林业出版社， 2013:1-3.

[13] LE N T， NGUYEN T M， TRAN V T， et al. Genetic diversity ofPanaxstipuleanatusTsai in North Vietnam detected by inter simple sequence repeat (ISSR) markers[J].Biotechnology&BiotechnologicalEquipment， 2016， 30(3):506-511.

[14] HUANG J， GE X， SUN M. Modified CTAB protocol using a silica matrix for isolation of plant genomic DNA[J].Biotechniques， 2000， 28(3):432-434.

[15] BEKIR D， MUSTAFA C， MURAT Ü， et al. Study of phylogenetic relationship of Turkish species of Matthiola (Brassicaceae) based on ISSR amplification[J].TurkishJournalofBotany， 2016， 40: 130-136.

[16] MARTINS M， TENREIRO R， OLIVEIRA M. Genetic relatedness of portuguese almond cultivars assessed by RAPD and ISSR markers[J].PlantCellReports， 2003， 22(1): 71-78

[17] MARYAM M， MEHDI Z， KHANIKIC G B. Genetic diversity and population genetic structure of pomegranate (PunicagranatumL.) in Iran using AFLP markers[J].ScientiaHorticulturae， 2010，126(4):441-447.

[18] 巩雪梅. 石榴品种资源遗传变异分子标记研究[D].合肥:安徽农业大学，2004.

GONG X M. Study on heredity and variation of pomegranate germplasm by means of molecular marker [D].Hefei: Anhui Agricultural University， 2004. (in Chinese with English abstract)

[19] 卢龙斗， 刘素霞， 邓传良，等.RAPD技术在石榴品种分类上的应用[J].果树学报， 2007，24(5):634-639.

LU L D， LIU S X， DENG C L， et al. Studies on classification of pomegranate cultivars by RAPD analysis[J].JournalofFruitScience， 2007， 24(5):634-639. (in Chinese with English abstract)

[20] AJALA E A， JBIRB R， MELGAREJOC P， et al. Efficiency of inter simple sequence repeat (ISSR) markers for the assessment of genetic diversity of Moroccan pomegranate (PunicagranatumL.) cultivars[J].BiochemicalSystematicsandEcology， 2014， 56：24-31.