游元飞

[摘要] 目的 分析糖尿病合并结核感染利用不同结核分枝杆菌检测方法进行检测的效果。方法 选择该院2018年1—6月中的100例糖尿病合并结核感染患者，收集患者痰标本分别应用4种不同方法进行结核分枝杆菌检测，分析检测结果。结果 100份痰涂片经涂片法检测的阳性率为27%，经快速培养法检测的阳性率为38%，经噬菌体法检测的阳性率为37%，经PCR法检测的阳性率为39%，涂片法阳性率明显低于其他3种方法（P<0.05）。 结论 噬菌体生物扩增法和荧光定量PCR法相较涂片法和培养法能够更准确、迅速完成结核分枝杆菌检测，可推广用于糖尿病合并结核感染的诊断中。

[关键词] 糖尿病；结核感染；结核分枝杆菌；检测

[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1672-4062（2018）12（a）-0059-02

结核病属于一类多发的慢性疾病，对患者健康有严重影响，糖尿病被认为是结核病的易感者，15%左右的肺结核患者伴发糖尿病，大部分都是先出现糖尿病，再出现肺结核[1]。研究发现，糖尿病患者出现结核病的可能性要高出正常人群多倍[2]。合并糖尿病的结核病患者发病急，病变主要为干酪渗出病变，应用抗结核病治疗会导致比较明显的不良反应，不良反应会引发糖尿病相关并发症，提升病变的复发率，增加耐药结核病患者比重[3]。所以针对糖尿病合并结核感染患者，做好早期的诊断具有重要意义，该研究具体以该院2018年1—6月中收治的100例糖尿病合并结核感染患者的100份痰标本为对象，分析4种不同方法进行结核分枝杆菌检测的效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以该院中的100例糖尿病合并结核感染患者的痰标本作为检测对象，应用法国生物梅里埃公司生产的BacT/ALERT 3D系统和试剂；选择英国BIOTEC Lab公司生产的噬菌体生物扩增法快速检测结核分枝杆菌试剂盒（FAST Plaque TBTM）；选择达安基因公司生产的荧光定量PCR诊断结核菌试剂盒。

1.2 方法

处理痰标本：收集好痰标本后，选择部分进行金胺O荧光染色涂片，其他的给予NALC-NAOH法前处理，完成处理后将2 mL PBS加入，重悬沉淀，分别实施噬菌体生物扩增、荧光定量PCR、快速培养。具体方法如下。

①快速培养法：选择经过前处理后的0.5 mL标本在培养瓶进行接种，加入经过溶解的抗生素0.5 mL，置于BacT/A-LERT 3D结核菌培养仪中进行培养，如果42 d之内没有显示阳性结果即确定为阴性。②荧光染色涂片法：依据《结核病诊断细菌学检验规程》开展具体的操作。③荧光定量PCR法：在离心管中置入经过前处理的标本0.5 mL，在15 000 r/min的速度下进行持续5 min的离心处理，除去上清液后借助TE缓冲液进行2次洗涤沉淀。将 DNA提取液50 μL加入沉淀并混匀，进行持续10 min的沸水浴，在10 000 r/min的速度下进行持续5 min的离心处理，在含荧光探针的PCR扩增体系中加入2 μL上清液，在6 000 r的速度下进行1 min的离心处理。PCR扩增条件：93℃下进行3 min的预变性，接着以93℃ 1 s、57℃ 30 s循环40次，并在37℃下延伸1 s。另外设立阴性对照以及阳性对照。完成扩增后利用检测仪获取循环阈值（CT）。结果判断：CT值没有显示数值为阴性，CT值≤38为阳性，CT值>38为实验灰度区，必须进行再一次实验，结果仍按照上述标准判断。④噬菌体生物扩增法：选择经过前处理之后的标本1 mL，加入PTB培养基15 mL，在4 000 r/min的速度下进行持续15 min的离心处理，除去上清液后将PTB培养基1 mL加入，重悬沉淀，转移到反应管内，在37℃的温度下孵育过夜。设立阴性以及阳性对照。在对照标本中混匀噬菌体0.1 mL，在37℃的温度下孵育1 h，将杀病毒劑0.1 mL加入混匀，放置在室温下5 min，将PTB培养基5 mL加入混匀，将5 mL 55℃恒温的FPTB琼脂、敏感细胞1 mL加入，置于平皿中，室温条件下放置让其定型，在37℃的温度下进行持续24 h的培养。结果判断：阳性对照噬菌斑≥20个，阴性对照噬菌斑<10个，标本噬菌斑≥20个为阳性，标本噬菌斑<20个为阴性。

1.3 统计方法

通过SPSS 22.0统计学软件对该研究获取的全部结果实施分析，[n（%）]表示计数资料，χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

涂片法检测显示阳性的有27例，阳性率27%；；PCR法检测显示阳性的有39例，阳性率39%噬菌体法检测显示阳性的有37例，阳性率37%；快速培养法检测显示阳性的有38例，阳性率38%。涂片法的阳性率明显低于其他3种方法（P<0.05），其他3种方法阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

结核病、糖尿病都属于我国发生率非常高的慢性疾病，且当前逐渐增多的患者同时伴有糖尿病、结核病，这类疾病病情比较复杂，在治疗上的难度大，同时停止治疗后会有比较高的复发率，相较于单纯结核病患者或者单纯糖尿病患者，预后明显更差[4]。临床必须注重做好糖尿病伴发结核病感染的早期诊断，做好糖尿病患者的结核分支杆菌感染预防及控制，使患者能够获得及时有效的治疗，预后能够得到改善。

从该研究结果可以得知，100份痰涂片经涂片法检测的阳性率为27%，经快速培养法检测的阳性率为38%，经噬菌体法检测的阳性率为37%，经PCR法检测的阳性率为39%。对比结果可以发现，金胺O荧光染色涂片法的阳性率较其他3种方法更低，其他3种方法均有30%以上的阳性率。类似研究发现，以快速培养法的检测结果当作标准，分析其他方法的敏感度，结果显示PCR法、噬菌体法的敏感性均超过90%[5]。相较于抗酸染色，荧光染色能够获得更高的检出率，不过荧光染色对检验人员的镜检水平要求较高。另外发现，涂片法用于检验中存在比较高的漏检率。

培养法被认为使检测结核分支杆菌的金标准，不过进行罗氏培养检出所需时间在6 h左右，虽然应用仪器使得检验所需时间得以缩短，不过得到阳性报告所需时间在1～3周之间，获取阴性报告所需时间为6周，这一情况使其明显不适用于临床诊断的实效性[6]。噬菌体生物扩增法对于结核分枝杆菌的检测具体应用的是噬菌体生物特异性、快速增殖的特点，存在非常高的特异性、敏感度，不过这一方法检验对标本有非常高的要求。有研究数据显示，糖尿病伴有结核感染患者应用噬菌体法进行痰标本结核分枝杆菌检验，阳性率为43.3%[7]，该研究结果与之比较有一定差异，分析是由于标本质量上存在差异导致。但研究显示噬菌体法、快速培养法用于糖尿病伴有结核感染患者结核分枝杆菌检验的检出率差异不明显，与该研究结果具有一致性。

荧光定量PCR法属于新型的聚合酶链式反应技术，特异度高，敏感度高，不过少数时候会因为扩增导致污染，进而出现假阳性结果，另外这一检验方法对检验实验室有着非常高的要求，无法推广应用于基层医院。有研究显示，荧光定量PCR法用于糖尿病合并结核感染患者结核分枝杆菌检测中阳性率在47%[8]，与该研究阳性率结果比较存在一定差异，分析是由于不同研究选取的痰标本存在差异造成。

针对糖尿病伴有结核感染的结核分枝杆菌检验中，涂片法、噬菌体法、荧光定量PCR法的应用能够保证检验的特异度以及获取结果的迅速性，相比之下，噬菌体法、荧光定量PCR法的应用价值更明显。培养法是结核分枝杆菌检验的金标准，结核感染诊断必须综合培养法检验的结果，不过因为培养法结果的获取无法及时满足临床诊断的实效性，所以如果在诊断中应用涂片法、噬菌体法、荧光定量PCR法有阳性表现，则应该高度怀疑为糖尿病伴发结核感染，结合培养法结果进行确诊。

[参考文献]

[1] 王敏娣，孙丽娜，梁慧，等.糖尿病合并结核感染诊断中结核分枝杆菌检测方法的比较[J].糖尿病新世界，2017，20（2）：66-67.

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[3] 谭英征，陈双华，肖鹏程，等.株洲地区北京基因型结核分枝杆菌感染与利福平耐药的相关研究[J].临床肺科杂志，2017，22（8）：1496-1499.

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（收稿日期：2018-09-12）