封竣淇,罗卫星,张依裕, 蔡惠芬*,罗 铮,徐 伟,翁吉梅,陈 说

(1.贵州大学 动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州省仁怀市黔北麻羊原种场，贵州 仁怀 564500 )

【研究意义】黔北麻羊是经原产地长期自然环境选择而成的贵州重要地方优质山羊品种之一[1]。因其具有食性广、适应性强、耐粗饲、适宜高寒山区饲养、肉质鲜、口感佳和膻味轻等优点[2]而深受广大消费者喜爱。近年来，随着广大居民消费观念的转变，对羊肉的需求量逐年增加，使黔北麻羊个体小、净肉率低和生长较缓慢的缺点日益突出。因此，通过分子标记辅助育种，选育高大、生长性状优良和肉质好、成熟快的黔北麻羊对提高其养殖经济效益具有重要意义。【前人研究进展】Dickkopf-1(DKK1)基因最早于1998年在非洲蟾蜍胚胎细胞中被发现，2000年被证实其为Dickkopf(DKKS)家族成员之一，在脊椎动物中DKKS家族还有DKK2、DKK3及DKK4等成员。DKK家族是一个保守基因家族，其家族基因结构的共同特点是由含1个信号肽序列、2段富含半胱氨酸(Cys1、Cys2)的保守结构域DKK-N和辅酯酶折叠(colipase fold)组成[3]。Cys1和Cys2分别位于氨基末端与羧基末端，二者形成的保守结构域被可变连接区域分割，通常由50～55个氨基酸组成。Liu C等[4]研究表明，DKK1基因由4个外显子和3个内含子构成，可影响机体肿瘤生成、毛羽发生和脂肪细胞的分化等，其保守结构域的存在对DKK1基因家族的生物学功能起着重要作用。近年来，前人对畜牧动物的研究主要集中在其骨骼形成调控、脂肪细胞分化及骨再塑等方面，其作用机理主要是DKK1基因编码一种分泌性糖蛋白，通过与Wnt蛋白竞争性地结合低密度脂蛋白受体相关的蛋白5/6(LRP5/6)来阻断经典Wnt/β-catenin信号通路，进而抑制 Wnt/β-catenin信号通路下游基因的转录状态，从而调节动物胚胎发育，参与其肌细胞生成、脂肪细胞分化、骨代谢、毛囊发育和肿瘤发展等。Qiang等[5]也在2008年通过实验证实了DKK1基因对调节骨代谢的分子机制。因此，DKK1基因作为Wnt信号通路的拮抗物，是调节动物骨骼生长发育的重要基因。【本研究切入点】以黔北麻羊为对象，采用DNA池结合PCR产物直接测序方法研究黔北麻羊DKK1基因CDS区及部分内含子的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNP)，应用生物信息学软件拼接黔北麻羊DKK1基因CDS区序列，并对其编码蛋白质进行生物信息学分析。【拟解决的关键问题】为黔北麻羊DKK1基因的深入研究及其种质资源的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

130只黔北麻羊，由贵州省遵义市习水县富兴牧业有限公司(国家级黔北麻羊保种场)与贵州省仁怀市黔北麻羊原种场提供。

1.2 试剂及仪器

1.2.1 主要试剂 琼脂糖(Biowest)；血液基因组提取试剂盒(生工生物)；2×EsTaqMaster Mix(英潍捷基)；DNA Ladder 2 000 Marker(英潍捷基)。

1.2.2 仪器 PCR仪(Bio-rad公司)，凝胶成像系统(Bio-rad公司)，超微量紫外分光光度计(Therom)，电泳槽和电泳仪(北京六一)，微型掌上离心机(北京东林昌盛)，漩涡混合器(上海汗诺)，移液枪(Eppendorf)。

1.3 羊血样品的采集

在黔北麻羊原种场，颈静脉采集羊血后注入抗凝管，放于冰盒内迅速带回实验室，放入-20 ℃环境保存备用。

1.4 DNA的提取与DNA池的构建

通过血液基因组试剂盒提取试验羊血液DNA，提取DNA用超微量紫外分光光度计测定其DNA浓度 。然后将DNA样品浓度稀释为100 ng/μl，每个DNA样品各取3 μl混匀后构建黔北麻羊DNA池。

1.5 引物设计与PCR扩增

参考NCBI山羊DKK1基因(GenBank登录号:NC_030833.1)，用Primer Premier 5.0软件在编码区设计3对特异性引物，用于扩增黔北麻羊DKK1基因编码区序列及部分内含子序列，引物送英潍捷基生物技术有限公司合成，其引物序列见表1。

PCR反应体系为10 μl：5 μl 2×TaqPCR Master Mix试剂，2 μl 双蒸水H2O，1 μl DNA样品，上、下游引物各1 μl。

PCR反应条件：预变性温度为95 ℃，时间5 min；变性温度为95 ℃，时间30 s；退火时间为30 s；72 ℃延伸30 s；共32个循环；终延伸温度为72 ℃，延伸7 min 30 s。PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果用凝胶成像仪观察。剩余PCR产物保存于4 ℃环境备用。

1.6 序列检测与生物信息学工具

1.6.1 序列检测 PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，选择条带明亮、清晰和胶片效果较好的PCR产物纯化后，委托北京诺赛基因组研究中心有限公司进行双向测序。测序结果用DNAstar和BioEdit软件进行比对分析，经手工拼接后获得黔北麻羊DKK1基因CDS区序列，对其进行开放阅读框分析，结合测序峰图筛选SNP位点。

表1 黔北麻羊DKK1基因的引物序列、退火温度及目的片段大小

1.6.2 生物信息学工具 采用Expasy-ProtParam及DNAstar软件分析编码产物的理化特性；采用Expasy-ProtScale进行疏水性与亲水性预测；采用SignalP4.1预测蛋白信号肽；采用Expasy-TMpred和TMHMM2.0在线跨膜蛋白软件预测跨膜结构域；用NetPhos 3.1 Server工具预测蛋白磷酸化位点；采用TargetP 1.1 Server工具预测亚细胞定位点；采用PORTER、SWISS-MODEL工具预测蛋白质二级结构和三级结构，采用MEGA6.0、DNAMAN软件分析序列的同源性并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 黔北麻羊DKK1基因的PCR扩增效果

D1.DKK1-1 primer; D2.DKK1-2 primer; D34.DKK1-34 primer; M.Marker 2000图1 黔北麻羊DKK1扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DKK1amplification products of Qianbei Ma Goat

由图1可知，黔北麻羊DKK1基因PCR扩增图谱的条带单一、清晰明亮、特异性好，与预期扩增的条带大小一致，可用于后续研究。

2.2 黔北麻羊DKK1基因CDS区的序列比对

通过DNAstar和BioEdit软件对测序结果进行手工拼接，并应用NCBI网站的ORF Finder程序对黔北麻羊DKK1基因的CDS区序列进行开放阅读框分析，获得1条全长为789 bp的核苷酸序列序列，共编码262个氨基酸，起始密码子为ATG,终止子密码子为TAA(图2)。序列比对结果结合测序峰图(图3)分析，筛选出8个SNPs位点，分别为第1内含子的C1626T位点，第3内含子的A3083G位点，编码区的T3000C、T3228C、T3238C、G3240A、T3271A和T3411C位点。其中，T3271A为错义突变，导致半胱氨酸(Cys)变为丝氨酸(Ser)，而其他编码区的SNP位点均为同义突变。同义突变虽然不影响编码的氨基酸序列，但同义突变可引起最小自由能、外显子拼接和蛋白质空间结构等改变，从而导致mRNA影响蛋白质表达量的变化，进而影响其功能。

2.3 黔北麻羊DKK1基因编码蛋白的生物信息学分析

2.3.1 黔北麻羊DKK1基因编码蛋白的理化特性 研究结果显示，黔北麻羊DKK1基因编码蛋白的分子量为 28 349.17 D，分子式为C1197H1907N385O366S25，理论等电点为8.88，有负电荷残基(Asp + Glu)20个、正电荷残基 (Arg + Lys)31个，在280 nm处的消光系数为15 690，脂肪系数为61.22，含有20种常见氨基酸。其中，以丙氨酸(Ala)的含量最高，占氨基酸总量的11.1 %；色氨酸(Trp)含量最低，占氨基酸总量的0.4 %。黔北麻羊DKK1基因编码产物的不稳定指数为42.66，根据Guruprasad原则该值大于40。表明，此编码蛋白相对不稳定。

图2 黔北麻羊DKK1基因CDS区的核苷酸和编码氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and coding amino acid in CDS region of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

图3 黔北麻羊DKK1基因的8个SNPs突变位点Fig.3 Eight SNPs mutant sites of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

2.3.2 黔北麻羊DKK1基因编码蛋白的疏水性与亲水性预测 由图4可知，在黔北麻羊DKK1基因编码蛋白的多肽链氨基酸序列中，以第16位亮氨酸(Leu)的分值最高，为2.778，表明其疏水性最强；第75位赖氨酸(Lys)的分值最低，为-3.067，表明其亲水性最强。用Expasy-ProtParam工具预测DKK1基因编码蛋白的亲水性平均值为-0.448。整体上看，肽链中的亲水性氨基酸数量高于疏水性氨基酸数量，结合预测的亲水性平均值看，整个多肽链表现为亲水性。

正值表示疏水，负值表示亲水The positive is the hydrophobic and the negative the hydrophilicity图4 黔北麻羊DKK1基因编码蛋白的疏水性与亲水性图谱Fig.4 Coding protein hydrophobicity and hydrophilicity of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

2.3.3 黔北麻羊DKK1基因的编码蛋白信号肽和跨膜结构 研究结果表明，黔北麻羊DKK1基因编码蛋白信号肽的平均值(S-score)为0.764S>0.5，预测该蛋白为分泌蛋白。由图5看出，DKK1基因的编码蛋白具有信号肽序列，剪切位点最有可能位于第31～32位氨基酸间；在第15～37位氨基酸间有1个典型的跨膜螺旋区，与该蛋白的疏水性区域基本一致。说明，DKK1蛋白可能是一种膜蛋白受体。

2.3.4 蛋白磷酸化与亚细胞定位预测 研究结果表明，黔北麻羊DKK1蛋白有25个磷酸化位点。其中，丝氨酸(Ser)14个，苏氨酸(Thr)9个，酪氨酸(Tyr)2个。在黔北麻羊DKK1基因的编码蛋白亚细胞中，有93.4 %的可能存在于细胞外，说明DKK1蛋白属分泌型蛋白。

图5 黔北麻羊DKK1基因的氨基酸序列信号肽图谱Fig.5 Signal peptide mapping of amino acid sequence of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

图6 黔北麻羊DKK1基因编码蛋白的三级结构Fig.6 The tertiary structure of coding protein of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

表2 黔北麻羊与8个物种DKK1氨基酸序列的同源性

注：山羊(XP_005698218.1)，绵羊(XP_011957844.1)，普通牛(NP_001192473.1)，野牛(XP_005904695.1)，马(NP_001254731.1)，人(NP_036374.1)，猪(NP_001138856.1)，家鼠(NP_034181.2)。

Note：Caprahircus(XP_005698218.1);Ovisaries(XP_011957844.1);Bostaurus(NP_001192473.1);Bosmutus(XP_005904695.1);Equuscaballus(NP_001254731.1);Homosapiens(NP_036374.1);Susscrofa(NP_001138856.1);Musmusculus(NP_034181.2).

2.3.5 黔北麻羊DKK1蛋白的二级和三级结构预测 研究结果显示，在黔北麻羊DKK1基因编码蛋白的二级结构中，α-螺旋(H)占9.1 %，β-折叠(E)占11.5 %，无规则卷曲(C)占79.4 %。从α-螺旋(H)和β-折叠(E)结构所占比例看，黔北麻羊DKK1基因编码蛋白属于mixed型蛋白。该蛋白的三级结构主要由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成(图6)，与二级结构一致；该编码蛋白与同源构建蛋白模型(SMTL id：3s2k.1.C)拥有94.25 %的相似度，具有较高可信度。

2.3.6 黔北麻羊DKK1氨基酸序列的同源性与系统发育树 同源性分析结果(表2)表明，黔北麻羊DKK1基因的编码蛋白与普通山羊和绵羊的同源性均较高，分别为99.6 %和98.8 %；与普通牛和野牛次之，分别为93.2 %和92.7 %；与猪和家鼠较低，分别为83.4 %和72.1 %。

由图7可知，用NJ 法构建9个物种DKK1氨基酸序列的系统发育树与其生物进化的物种树基本一致，符合物种进化规律。说明，该基因较保守。黔北麻羊与家鼠的遗传距离显示，不同物种的DKK1基因存在一定差异。

图7 NJ法构建的9个物种DKK1氨基酸序列的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree of DKK1amino acid sequence of 9 species

3 讨 论

Dickkopf-1(DKK1)是一种Wnt信号通路可溶性胞外抑制剂，前人对人体DKK1基因的研究多集中在骨质疾病、肿瘤及癌症等方面[6-8]。Tai N等[6]研究表明，DKK1抗体可加快骨形成和增加骨密度，可用于治疗骨质疏松症；Forget M A等[7]研究指出，几种常见癌症中的DKK1表达式可作为癌症预后预测的依据。对动物DKK1基因的研究主要集中在生物学功能、机理研究及生产性状的关联分析方面。Hashimoto H等[8]研究发现，在斑马鱼胚胎发育早期，DKK1的表达量可影响其骨骼发育，说明DKK1基因的表达量对动物骨骼生长有调控作用，骨骼的发育可影响动物的体尺等生长性状，而选育生长性状优良个体则能显著和快速的提高其养殖经济效益。因此，研究黔北麻羊DKK1基因的SNP位点与其生长性状的相关性，寻找与生长性状差异显著的SNP位点，以提高黔北麻羊的生产性能。Liu等[4]研究表明，猪DKK1基因第二内含子G1757A的突变与猪眼肌面积呈显著差异(P=0.0281)，AG型与GG型差异显著(P<0.05)；眼肌面积是肉质性状的代表性指标之一，与家畜产肉性能有很强的相关性，且DKK1基因对猪肉质的控制起着重要作用。因此，研究该基因与黔北麻羊肉质性状的关联性，以提高黔北麻羊养殖效益。曹贵玲等[9]研究发现，山羊群体产绒量与其DKK1基因的多态性有关，A为优势等位基因，其对产绒量有利；而黔北麻羊属于肉皮兼用型山羊，属粗毛羊品种，其羊毛价格低，建议今后开展相关研究。高建斌等[10]研究显示，不同突变位点不同基因型秦川牛在体尺和肉质指标中存在不同程度的显著差异；而黔北麻羊却缺少相关研究，建议进一步研究黔北麻羊DKK1基因与体尺和肉质指标的关联性，为其优良品种选育工作的开展奠定基础。

4 结 论

(1)与普通山羊的CDS区序列比对结果显示，在黔北麻羊DKK1基因的CDS区序列中有8个SNP位点，分别为第1内含子C1626T位点，第3内含子A3083G位点，编码区的T3000C、T3228C、T3238C、G3240A、T3271A、T3411C位点。其中，T3271A为错义突变，导致半胱氨酸(Cys)变为丝氨酸(Ser)，而其他编码区的SNP位点均为同义突变。

(2)生物信息学分析结果表明，黔北麻羊DKK1基因CDS区由一条长789 bp的核苷酸序列构成，共编码262个氨基酸，蛋白分子量为 28 349.17 D。

(3)DKK1基因编码蛋白的疏水性与亲水性预测结果显示，整个多肽链表现为亲水性。信号肽及跨膜结构预测结果表明，DKK1基因的编码蛋白具有信号肽序列，剪切位点最有可能位于第31～32位氨基酸间；在第15～37位氨基酸间有1个典型的跨膜螺旋区。

(4)蛋白磷酸化与亚细胞定位预测结果表明，黔北麻羊DKK1蛋白有25个磷酸化位点，有93.4 %的可能存在于细胞外，说明DKK1蛋白是分泌型蛋白。研究结果显示，黔北麻羊DKK1基因编码蛋白的二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成，属于mixed型蛋白，且三级结构与二级结构一致。DKK1氨基酸序列对比和系统进化分析结果显示，黔北麻羊DKK1基因编码蛋白与普通山羊、绵羊和牛等物种均具有较高同源性；NJ法构建的黔北麻羊基因系统发育树与其生物进化的物种树基本一致。

(5)不同物种的DKK1基因在进化上均较保守，有一定程度的遗传多样性，并在生物体中影响其多个生长发育过程，因此，该基因可作为动物骨骼生长发育研究和相关疾病鉴定的重要候选基因。

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