陈 文，孙燕芳，吴石平，李添群，唐靖文，龙海波*

(1.贵州省农业科学院 植物保护研究所，贵州 贵阳 550006；2.中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所，海南 海口 571101；3.贵州省修文县植保植检站，贵州 修文 550200；4.贵州省修文县猕猴桃产业发展局，贵州 修文 550200)

【研究意义】猕猴桃根结线虫病是猕猴桃生产上重要病害之一，常造成猕猴桃植株的根部肿大呈瘤状或根结状，后期瘤状物和病根腐烂，地上部表现整株萎蔫死亡，影响树势生长，严重降低猕猴桃产量及品质。【前人研究进展】在我国陕西、福建、湖南和贵州等地均有危害报道，主要为南方、花生、爪哇和北方根结线虫等种类，其发病率在10 %～100 %[1-5]。修文县是贵州猕猴桃主产区，截止2014年全县猕猴桃种植面积为9000 hm2，受根结线虫危害面积20 hm2[5]，近年来猕猴桃种植面积逐年增加，很多新建果园及苗圃都受到根结线虫危害。由于根结线虫不同种类对作物危害特性不同，开展根结线虫鉴定，对于抗病育种、植物检疫、掌握病原线虫的生活习性及防治等具有重要指导作用。【本研究切入点】鉴于贵州猕猴桃根结线虫危害重且种类未见详细报道。【拟解决的关键问题】于2016年2月至2017年4月调查贵州修文县猕猴桃主产区根结线虫的发生危害情况，采用会阴花纹形态特征[6]及结合PCR技术[7-12]鉴定根结线虫种类，为该猕猴桃根结线虫的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

在根结线虫发生危害的猕猴桃产区，采集根结线虫病根，在显微镜下用挑针和毛笔从病根组织中直接分离雌成虫置于含去离子水的凹形皿中，备用。

1.2 根结线虫的调查

2016-2017年调查贵州修文县猕猴桃产区的折溪村、高寨村、上洞村、平摊村、中哨村、绿水村和下洞村等地12个果园和3个苗圃根结线虫发生情况。采用5点取样法对每一果园猕猴桃根部进行取样，挖取表土取猕猴桃须根，每个果园取10～12株，苗圃调查数量视面积及农事操作不同。采集根结线虫病根，标注信息，带回实验室分离根结线虫。

1.3 根结线虫的形态观察

参照张绍升的方法[13]并改进制作根结线虫雌成虫会阴花纹，在显微镜下观察。

1.4 rDNA-ITS区序列扩增

在各个村随机挑取4个雌成虫标样，共20个标样，分别置于10 μl灭菌双蒸水的PCR管中，编号见表1。提取DNA参照万新龙的方法改进[14]。对PCR管中线虫点动离心后放入-20 ℃冷冻3 min，利用10 μl小枪头研磨固体，加入7 μl 10×PCR Buffer，3 μl蛋白酶K(20 mg/mL)点动离心，置于-20 ℃冷冻90 min，后取出轻弹混匀后PCR 仪中65 ℃温育90 min，接着95 ℃保温 10 min。样品于12 000 r/min 离心1 min，取其上清液用于PCR 扩增或于-20 ℃保存备用。利用Vrain设计的线虫通用引物V5367/26S(TTGATTACGTCCCTGCCCTTT/TTTC ACTCGCCGTTACTAAGG)扩增ITS区，退火温度55 ℃，35次循环[9]，对单个线虫DNA进行PCR扩增。

1.5 特异性序列扩增

每个地点随机选取1个ITS区扩增阳性样品，共5个样品进行特异性片段扩增分析。

选择南方、花生和爪哇根结线虫的特异性引物，Meng等[11]设计的南方根结线虫特异性标记MIF/MIR(GTGAGGATTCAGCTCCCCAG/ACGAGGAACA TACTTCTCCGTCC)，退火温度62 ℃，目标条带955 bp，Zijlstra等[12]设计的花生根结线虫特异性标记Far/Rar(TCGGCGATAGAGGTAAATGAC/TCGGCGA TAGACACTACAACT)，退火温度61 ℃，目标条带420 bp及爪哇根结线虫特异性标记Fjav/Rjav(GGTGCGCGATTGAACTGAGC/CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC)，退火温度64 ℃，目标条带670 bp，对单个线虫DNA进行PCR扩增。

1.6 PCR产物的回收

PCR产物采用1.8 %的琼脂糖凝胶110 V电泳30 min，用1× TAE作为电泳缓冲液，并在紫外灯下观测照相。PCR产物采用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收纯化，具体操作步骤参照试剂盒操作说明。

1.7 PCR产物的克隆及序列测定

表1 供试根结线虫编号及来源

表2 根结线虫在贵州修文不同地区的发生程度

将纯化后的PCR产物与PGEM-T Easy Vector在4 ℃下连接12～16 h，采用热击法转化到E.coliDH5a感受态细胞中。在含有Ampicillin(100 mg/L)，PTG(24 mg/L)和X-gal(200 mg/L)的LB筛选平板上挑取单个白色菌落于含有Ampicillin(100 mg/L)的LB液体培养基中摇培过夜。用质粒小提试剂盒提取重组质粒DNA，经PCR鉴定后，筛选含有正确插入片段的重组克隆送诺赛基因有限公司进行序列测序。

1.8 序列分析

采用Lasergene软件进行序列拼接，利用Bioedit软件对测定的序列进行比对分析，利用paup4.0制作聚类树。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃根结线虫危害及发生

2016年2月至2017年4月调查修文猕猴桃产区根结线虫情况发现，猕猴桃树受害，树势弱，植株叶片小、发黄，根部须根出现根瘤状，后期根瘤状须根腐烂。由表2可见，在贵州修文县折溪村、高寨村、上洞村、平摊村和中哨村等地的猕猴桃成年果园及苗圃均有根结线虫发生，其中折溪村猕猴桃成年果园根结线虫发生率最高，为80.00 %；高寨村发生率次之，为30.30 %；中哨村发生率最低，仅13.33 %。在绿水村绳桥苗圃及下洞村乌泥苗圃未见其发生。

2.2 根结线虫的形态观察

经猕猴桃根结中的根结线虫分离及雌成虫会阴花纹图1发现，分离到的根结线虫雌成虫会阴花纹有高而方的背弓，由平滑形线纹组成，线纹呈波浪状，细到粗，清楚，有些线纹在侧面分叉，无明显侧线。

2.3 根结线虫的分子鉴定

利用通用引物V5367/26S对来自5个村的20个线虫DNA标样进行扩增表明，利用V5367/26S引物对20个标样进行扩增(图2)，有15个标样表现阳性，获得长度约为760 bp的电泳条带。对来自5个不同地方的ITS区扩增阳性样品进行测序及同源性比对分析，表明其均与南方、爪哇和花生根结线虫的ITS序列一致性高达99 %～100 %；在NCBI数据库中下载南方、花生、爪哇和北方根结线虫序列与5个标样序列进行聚类分析表明5个样品与南方、花生和爪哇根结线虫的序列聚在1个分枝上且置信度为100，表明贵州修文猕猴桃根结线虫可能为南方、花生或爪哇根结线虫中的1种或几种(图3)。

图1 根结线虫雌虫分离及会阴花纹观察Fig.1 Separation of female root knot nematodes and its perineal pattern

M为MarkerD2000(下同)，1～20孔分别为Z1、Z2、Z3、Z4、G1、G2、G3、G4、S1、S2、S3、S4、Z1、Z2、Z3、Z4、ZS1、ZS2、ZS3、ZS4M,Marker D2000; 1-20, Z1,Z2, Z3, Z4,G1, G2,G3,G4,S1, S2, S3, S4, Z1, Z2, Z3, Z4, Z1, ZS2, Z3 and ZS4 respectively图2 根结线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增图谱Fig.2 PCR amplification pattern of rDNA-ITS sequence of root knot nematodes

图3 基于根结线虫ITS序列的聚类树Fig.3 Clustering analysis based on ITS sequency of Meloidogyne incognita

1～5孔为Z2、G1、S1、Z1、ZS1，6～10孔为Z2、G1、S1、Z1、ZS11-5, Z2, G1, S1, Z1 and ZS1; 6-10, Z2,G1, S1, Z1 and ZS1 respectively图4 PCR扩增根结线虫rDNA-ITS序列及南方根结线虫特异性序列Fig.4 rDNA-ITS sequence amplified by PCR and specific sequence of Meloidogyne incognita

利用南方、花生和爪哇根结线虫特异性引物MIF/MIR，Far/Rar和Fjav/Rjav对20个DNA标样进行扩增，仅MIF/MIR引物获得约955 bp的电泳条带，选取上述5个不同地方的DNA样品特异性片段(图4)，进行胶回收、重组克隆及测序，经过Blast N 同源性搜索比对显示，5个标样与 NCBI 数据库中的南方根结线虫的序列(登录号：JN005841.1.1)相似度均为100 %。

3 讨 论

范学科等[1]报道，陕西周至和户县的猕猴桃根结线虫为南方根结线虫；张绍升等[2]报道，福建建宁县猕猴桃根结线虫由爪哇和南方根结线虫引起，爪哇根结线虫为优势种；方言祖等[4]报道，湖南猕猴桃根结线虫为南方和花生根结线虫，南方根结线虫为优势种；而贵州猕猴桃根结线虫种类鉴定未见详细报道。本研究通过根结线虫的形态观察结合分子生物学技术对贵州修文猕猴桃主产区根结线虫进行鉴定，仅发现了南方根结线虫，鉴于贵州修文近年来从湖南大量引进猕猴桃苗木，且报道湖南猕猴桃根结线虫危害种类主要为南方和花生根结线虫，在贵州果园不排除存在花生根结线虫危害。同时由于采样区域及标样数量有限，可能存在其他危害种类，为准确掌握贵州修文猕猴桃根结线虫群体分布，可扩大样本采集区域以及标样数量开展鉴定，也便于制定不同防治策略。

分子鉴定速度快、成本低、效率高等优势在根结线虫快速鉴定中广泛应用，万新龙等[10]对根结线虫ITS序列进行分析发现，我国农作物和蔬菜上的根结线虫主要由南方、北方、爪哇和花生根结线虫引起。本研究利用ITS区鉴定的猕猴桃根结线虫，通过数据分析发现，仅能将北方根结线虫分开，而并不能将南方、爪哇和花生根结线虫区分开来，为此选择了南方、爪哇和花生根结线虫特异性引物进行鉴定，在试验中扩增ITS区及南方根结线虫特异性片段时发现有4个标样均表现为阴性，主要原因是单条雌成虫DNA提取失败造成。

4 结 论

通过根结线虫会阴花纹形态观察，ITS区及特异性序列分析表明，贵州修文猕猴桃根结线虫危害种类主要为南方根结线虫。

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