张倩男，王晓敏,芮文婧，胡学义，胡新华，付金军，高艳明, 2，，李建设, 2, ，张亚红, 2, *

(1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏设施园艺(宁夏大学)技术创新中心，宁夏 银川 750021；3.宁夏现代设施园艺工程技术研究中心，宁夏 银川 750021；4.宁夏巨丰种苗有限责任公司，宁夏 银川 750021)

【研究意义】番茄(Solanumlycopersicum)为茄科一年生或多年生草本植物，原产于中美洲和南美洲，现作为食用蔬果已被全球性广泛种植，因其味美多汁并含有丰富矿物质以及维生素和番茄红素等活性物质，一直都深受人们的喜爱。此外，番茄是自花授粉型植物，适应性广、产量高且栽培方式多样，还可以作为重要的蔬菜加工原料，在提高人民的生活水平和加快经济发展中起着重要作用[1]。【前人研究进展】遗传多样性是指种内不同种群之间或一个种群内不同个体之间的遗传变异，多样化的遗传资源是品种改良的基础[2-3]。由于有限的驯化资源和长期对有益性状的高压选择，栽培种番茄的遗传背景越来越狭窄，因此种质资源的广泛收集、鉴定、繁殖和传播对于番茄育种至关重要[4]。遗传多样性具有可遗传性和可标记性两个基本特征，因此生物所有存在差异表现的基因突变型均可作为遗传标记。遗传标记包括：形态标记、细胞学标记、生化标记和分子标记，其中形态标记与分子标记相结合是研究作物遗传多样性的有效途径[3]。对于番茄种质的遗传多样性有很多学者已经进行了比较深入的研究[5-6]，龚亚菊[7]等对49份大果番茄的农艺性状进行遗传多样性分析和聚类分析，筛选出6份综合性状优良的种质材料应用于大果番茄育种和生产中。Kochieva[8]对58个普通和野生番茄品种进行SSR分子标记鉴定，研究发现在扩增出的318个片段中，多态性率为95.6 %。邓学斌[9]等分别利用20个表型性状和均匀覆盖12条染色体的40个SNP标记，对3026份加工番茄同类型种质资源进行10种初始核心种质的构建。番茄DNA分子标记在番茄抗病虫害(白粉病、烟草花叶病毒病、黄化曲叶病毒病和根结线虫等)育种中应用比较广，提高了育种效率[10-11]。李亚玲[12]利用SNP标记鉴定47份番茄是否能够抗根结线虫病，最终筛选出3份番茄抗病材料。彭祥珍[13]利用田间接种鉴定和分子标记对72份种质资源进行筛选，获得11份含Ty-I基因的种质资源。目前，大多学者都只探讨了番茄的部分品质性状或利用单一的方法对其进行分类，而表型性状调查和分子鉴定结合起来对番茄种质资源遗传多样性进行分析鲜有报道。【本研究切入点】本研究采用多元统计法[14],结合形态学标记和抗病性分子标记对收集到的117份番茄种质资源进行遗传多样性分析。【拟解决的关键问题】以期明确各种质资源材料的综合性状特性，为这些种质材料在番茄品质改良方面的利用提供依据，进而为番茄种质资源研究和育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来源于宁夏大学农学院园林系蔬菜课题组和宁夏巨丰种苗有限责任公司共同收集的117份番茄种质材料，编号依次为R1～R117。

1.2 试验方法

试验材料于2016年10月播种于宁夏大学试验农场育苗温室，每份种质材料播种9株在72孔穴盘中进行育苗，育苗基质为草炭和蛭石(2︰1)及有机肥料，待其长到5～6片真叶时选取大小均匀的幼苗，12月4日定植于宁夏大学试验农场日光温室。田间沟心距1.2 m，株距30 cm，垄高20 cm，采用单行栽植，常规田间管理。

1.3 表型性状调查

表型性状调查包括：首花序节位、单花序果数、果柄长度、果实纵径、果实横径、果型指数、果梗洼大小、单果重、硬度、可溶性固形物含量、果肉厚、心室数、单果种子数、叶片长、叶片宽、成熟果色、生长习性、生长势、叶片类型、叶片形状、绿肩有无、果顶形状共22个重要农艺性状，具体方法参照《番茄种质资源描述规范和数据标准》[15]， 并结合种质材料生长的情况略作调整。其中用RHS Colour Chart色卡测定成熟果色，用MNT-150T游标卡尺进行测量果柄长度、果实纵横径、果梗洼大小、叶片长宽，可溶性固形物含量采用TD-45糖度计测定，果实硬度用GY-4硬度计进行测量。

1.4 抗病标记分子检测

番茄材料生长期间，取少量幼嫩叶片保存于-80 ℃超低温冰箱待用，用改良后的碱式法[16]提取基因组DNA，最终稀释浓度至50 ng·μl-1，置-20 ℃冰箱保存。根据前人研究结果收集到抗TY病毒病、花叶病毒病、根结线虫病、叶霉病4种病害的5个分子标记分别为：Ty1[17]、Ty3[18]、Tm-2a[19]、Mi[18]和Cf9[20]，引物由北京奥科鼎盛生物有限公司进行合成。

PCR反应总体积为10 μl，反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，最适温度退火30 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。将PCR扩增反应产物于1.5 %的琼脂糖凝胶中电泳检测[16]，电泳程序为：200 V电压，电泳50 min，用凝胶成像系统观察拍照，并记录电泳结果。在扩增产物电泳图中，找出与抗病性连锁的目标条带，有抗性条带的记为“R”，为抗病材料；有感病条带的记为“S”，为感病材料。

1.5 数据统计及分析

选取种质材料间存在较大差异的质量性状包括：成熟果色、生长习性、生长势、叶片类型、叶片形状、有无绿肩、果顶形状、抗TY病毒病、抗番茄花叶病毒、抗根结线虫病和抗叶霉病，共11个质量性状分析其频率分布和多样性指数。对首花序节位、单花序果数、果柄长度、果实纵径、果实横径、果型指数、果梗洼大小、单果重、硬度、可溶性固形物含量、果肉厚、心室数、单果种子数、叶片长和叶片宽15个数量性状进行平均值、标准差、变异系数、遗传多样性指数、特征值、贡献率分析[21]。

数据整理在Excel 2007中进行，利用SPSS 20.0软件进行方差分析和相关性分析。基于平均值和标准差对数据进行10个等级的划分，每0.5σ为一级，σ为标准差，计算Shannon-Wiener多样性指数(H′)，其计算公式为：H′=-∑PilnPi(i=1,2,3…), 其中Pi是某性状第i个级别的材料数占总材料数的百分比[22]。利用SAS 8.2软件采用UPGMA法进行聚类分析，绘制树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 数量性状变异分析

根据表型性状田间考查结果，对可溶性固形物、果梗洼大小、果实纵横径、单果重等15个表型性状进行统计分析，计算其变异幅度、均值、标准差、变异系数和F值，如表1所示，单果重和单果种子数的变异幅度较大，标准差也相对较高分别为61.73和42.13，具有较高的离散程度。从变异系数可发现，117份供试材料在各数量性状中具有不同程度的变异，其中单果种子数、心室数、单果重、硬度、果型指数的变异系数相对较高，依次为61.70 %、52.27 %、46.55 %、33.04 %、30.12 %，均达到30 %以上，表明其具有较高的变异程度，果梗洼大小和果肉厚的变异系数较小，分别为3.53 %和7.21 %，说明其变异程度低。通过计算F值发现，种质材料各表型性状的遗传差异达到极显著水平，说明供试种质材料间存在极大的遗传差异。

2.2 表型性状遗传多样性分析

2.2.1 质量性状遗传多样性分析 对供试的117份番茄种质资源材料的11个质量性状(包括番茄黄化曲叶病、花叶病毒病、根结线虫病、叶霉病4种病害的5种抗病分子标记检测结果)进行遗传多样性分析，如表2所示。通过计算其遗传多样性指数发现：11个质量性状的遗传多样性指数变化范围在0.366～1.198，成熟果色和果顶形状的变异类型较为丰富，遗传多样性指数相对较高，分别为1.196和1.198，其中成熟果色主要以红色和粉红色为主，频率分别为37.6 %和34.2 %，占到总材料数的71.8 %，而成熟果色为黄绿色和黄色的材料很少，两者共占总材料数的3.4 %。果顶形状多呈圆平状，分布频率为41.03 %，微凸状果顶的材料频率为14.53 %，这些材料较为符合商品果的果顶形状要求。生长势的变异类型与成熟果色和果顶形状同样丰富，其遗传多样性指数为0.775，生长势较强的材料数最多，占总材料的44.44 %。所有供试种质材料以无限生长习性为主，分布频率高达86.32 %，有限生长型的仅占13.68 %；以无果肩为主，分布频率为84.62 %，无果肩的材料分布频率为25.38 %。在第二穗果成熟期对番茄叶片类型及叶片形状这两个叶部性状进行调查，通过计算得到其遗传多样性指数分别为0.940和0.674，叶片类性以普通型居多，频率达到63.25 %；其次为复宽型，分布频率为21.37 %；叶片形状以羽状复叶为主，占总材料数的59.83 %。通过对117份种质资源材料进行抗病标记检测，发现抗黄花曲叶病的材料仅占总数的5.12 %，抗花叶病毒病的材料占11.97 %，大多数材料均抗根结线虫和叶霉病，频率分别为76.07 %和88.03 %。总体看来，质量性状的遗传变异均较为丰富。

表1 番茄种质资源数量性状遗传多样性分析

注：* 在 0.05 水平上显著相关；** 在0.01 水平上极显著相关。

表2 番茄种质资源质量性状频率分布和多样性指数

注：成熟果色：1黄绿：FAN3 144A-145A，2橘黄：FAN4 163A，3红：FAN4 169A-178C,4红褐：165A-N170A,5粉：179A-N180C；生长习性：1有限，2无限；生长势：1极弱，2弱，3中，4强，5极强；叶片类型：1普通型，2薯叶型，3复宽型，4复细型；叶片形状：1羽状复叶，2二回羽状复叶；果肩：1有，2无；果顶形状：1深凹，2微凹，3圆平，4微凸，5凸尖；黄化曲叶病、花叶病毒病、根结线虫病、叶霉病：1感，2抗。

2.2.2 数量性状遗传多样性分析 对供试的117份番茄种质资源材料的14个数量性状进行遗传多样性分析，计算出其遗传多样性指数(表3)，结果表明：14个数量性状的遗传多样性指数分布范围在1.363～2.049，其中首花序节位和果肉厚这2个性状遗传多样性指数较高，分别为2.049和2.048，表明其遗传变异较为丰富；遗传多样性指数最低的性状为果型指数，为1.363，表明其变异类型相对较少；14个数量性状中，有12个性状的遗传多样性指数均大于1.9，表明数量性状的遗传多样性较为丰富。

2.3 相关性分析

为进一步了解供试材料不同性状之间的关联度，提高种质性状的选择效率，对117份种质材料的15个数量性状进行遗传相关性分析，表4表明：与心室数呈极显著相关的性状最多，有9个，其中与果实纵径、果梗洼大小、单果重呈极显著正相关，与首花序节位、单花序果数、果实横径、果型指数、硬度、果肉厚呈极显著负相关，与单果重的相关系数最高，为0.716，初步表明心室数与单果重的遗传相关性最大；与单果重呈极显著相关的性状数目次之，包含8个，其中与果实纵径、果实横径、果梗洼大小、心室数、单果种子数呈极显著正相关，与单花序果数、果型指数、可溶性固形物含量呈极显著负相关。首花序节位仅与心室数呈极显著负相关，相关系数为-0.258；叶片宽仅与单花序果数呈极显著正相关，相关系数为0.250。不同性状间存在着复杂的相关关系，且大部分都表现为显著或极显著的相关性。

2.4 主成分分析

表3 番茄种质资源数量性状遗传多样性分析

表4 15个数量性状相关性分析

注：* 在 0.05 水平(双侧)上显著相关；** 在0.01 水平(双侧)上极显著相关。1:首花序节位；2:单花序果数；3:果柄长度；4:果实纵径； 5:果实横径； 6:果型指数；7:果梗洼大小；8:单果重； 9:硬度； 10:可溶性固形物含量；11:果肉厚；12:心室数；13:单果种子数；14:叶片长；15:叶片宽。

对117份种质材料的遗传差异达极显著的15个数量性状及变异类型丰富的3个质量性状进行主成分分析，如表5所示，前8个的主成分的特征值大于或近似等于1，累计贡献率为80.8 %。第一主成分特征值为4.564，贡献率为24.0 %，其中单花序果数的特征向量最大，为0.413，首花节节位、果实纵横径、果实硬度的特征向量也相对较大，均大于0.300，表明第一主成分的影响因子主要是花数和果实大小的性状。第二主成分的特征值为2.479，贡献率为13.1 %，果型指数和单果重的特征向量较大，可见这一主成分主要与果型和果重相关。 第三主成分心室数的特征向量较大，果顶形状的特征向量有较高的负值，这2个性状均与果实形状相关。第四主成分的贡献率主要由可溶性固形物含量、单果种子数及成熟果色这3个性状影响，其特征向量分别为0.418、-0.470和0.453。在第五主成分中，生长势和叶片形状的特征向量较大，尤其是叶片形状，特征向量为0.511，这一主成分贡献率主要由叶片形状决定。第六主成分的贡献率为5.6 %，主要是由果柄长度影响，其特征向量为0.588。第七主成分中生长势的特征向量为负值最大，表明这一主成分大时，生长势较弱。第八主成分中，生长势和果梗洼大小的特征向量较大，表明这一主成分主要影响因子为这2个性状。

表5 番茄种质资源18个性状的主成分分析

2.5 聚类分析

对117份种质的26个性状进行聚类，分析其亲缘关系远近，结果表明(图1)：供试种质在欧式距离为0.78时可聚为Ⅶ大类，第Ⅰ类包括19份材料，第Ⅱ类包括35份材料，第Ⅲ类包括50份材料，第Ⅳ类包括10份材料，第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ类各包括1份材料，均属特殊材料。Ⅶ个番茄类群的质量性状描述如表6所示，各个组群表型性状特征如表7所示。通过统计发现，同时抗叶霉病、根结线虫病这2种病害的材料有24份，同时抗叶霉病、花叶病毒病的材料有10份，同时抗Ty1、叶霉病的材料有2份，同时抗Ty3、根结线虫病的材料有1份。同时抗3种病害的材料有3 份，其中一份抗Ty3、根结线虫病、花叶病毒病，另一份抗花叶病毒病、根结线虫病、叶霉病，还有一份抗Ty1、叶霉病、根结线虫病。这40份种质资源可以作为多抗育种材料进行收集利用。

3 结 论

优良基因的发现和利用对新品种的选育极其有利，通过遗传多样性分析育种材料的遗传变异和遗传背景是育种研究的基础。农艺性状的调查测定相对简单，易操作，更直观，是种质资源研究最基本的方法和途径，也是分类不可缺少的重要依据之一[19]。

4 讨 论

4.1 各性状的差异分析

表6 组群内各个表型质量性状描述

表7 番茄不同类群性状的平均值

通过对117份番茄种质资源的数量性状进行变异分析，发现单果种子数、心室数、单果重的变异系数高，均达到45 %以上，表明这3个性状的变异程度高，F值表明各种质材料表型性状的遗传差异都达到极显著水平，说明供试种质材料间存在极大的遗传差异。对供试种质材料的数量性状和质量性状进行遗传多样性分析，结果显示叶片长、叶片宽、首花序节位、果肉厚、果实横径、单花序果数和果柄长度的遗传多样性指数均大于2.000，表明这些性状的遗传差异大，遗传变异高。通过相关分析发现果实纵径、果实横径、果梗洼大小、心室数、单果种子数这几个性状之间的相关性较高，心室数与各性状呈现负相关。

4.2 主成分分析和聚类分析的应用

通过对遗传差异达极显著的15个数量性状及变异类型丰富的3个质量性状进行主成分分析，前8个的主成分累计贡献率为80.8 %，最终选择单花序果数、果型指数、单果重、心室数、可溶性固形物含量、单果种子数、成熟果色、生长势、叶片形状、果柄长度这几个性状作为主要因子。通过聚类分析在欧式距离为0.78时将供试种质材料分为Ⅶ大类，第Ⅰ类材料多为橘色，果型好且果肉厚，可作为观赏品种进行培养；第Ⅱ类材料果实体积大，单果种子数少，红色果，可作为加工类番茄育种材料；第Ⅲ类材料果型偏扁圆，硬度大，可溶性固形物含量高，果色多为红色，可作为培养精品果的种质材料；第Ⅳ类材料果肉厚，多为橘色果，较早熟，可在番茄品种改良育种中发挥作用。

4.3 抗病性分子标记检测

对供试材料进行抗病性分子标记检测，发现抗Ty-1、Ty-3的材料较少，共占总材料的5.12 %，在后期抗病育种中应加强该类种质材料的收集；抗叶霉病、抗根结线虫病的材料相对丰富，分别占总材料的88.03 %和76.07 %，可作为抗源材料在抗病育种中进行利用。通过统计未发现4种病害均抗的材料，仅有3份材料可同时抗3种病害，在后期会利用分子平台通过抗性基因导入等方法培育高抗番茄品种。

图1 番茄种质资源聚类分析Fig.1 Cluster analysis of tomato germplasm

4.4 种质资源遗传多样性分析方法

形态与分子2种标记均可反映出番茄种质资源品质性状的遗传多样性，但是不同的生态环境和种植模式对番茄的表型性状有较大影响，长期在同一生态环境下进行种植，虽对其基因型无影响，但形态和生育期会发生一定程度的改变[6]，因此形态标记与分子标记相结合是研究作物遗传多样性的有效途径。本研究选取的26个性状中，有23个为表型性状，易受环境、基因显隐性及栽培措施等因素影响，在种质遗传多样性分析上还具有一定的局限性，因此，在之后的研究中会结合SSR分子标记及SNP分子标记更近一步检测各种质资源材料的遗传多样性，以期为番茄地方品种改良提供有效依据，为番茄种质资源研究和育种提供参考。

[1]徐鹤林，李景富. 中国番茄[M].北京：中国农业出版社，2007.

[2]刘希艳，郑 峥，邓学斌，等. 中国加工番茄资源遗传多样性分析[J]. 园艺学报，2016，43(3)：485-495.

[3]林 涛. 番茄基因组多样性和演化的遗传学基础[D]. 中国农业大学，2016.

[4]王 涛. 番茄遗传多样性及几个重要农艺性状的关联分析[D]. 沈阳农业大学，2016.

[5]杜敏敏，周 明，李常保，等. 番茄分子育种现状与展望——从基因克隆到品种改良[J]. 园艺学报，2017，44(3)：581-600.

[6]王晓静. 番茄种质资源品质性状遗传多样性研究[D]. 西北农业大学，2010.

[7]龚亚菊，吴丽艳，黎志彬，等.大果番茄种质资源的遗传多样性和聚类分析[J].西南农业学报，2013，26(6)：2447-2450.

[8]Kochieva E Z, Ryzhova N N, Khrapalova I A. Genetic diversity and phylogenetic relationships of the genusLycopersicon(Tourn.)Mill.as revealed by inter-simple sequence repeat(ISSR) analysis[J]. Genetika, 2002, 38(8)：1133-1142.

[9]邓学斌，刘 磊，闫 喆，等.加工番茄核心种质构建及其遗传背景分析[J].园艺学报，2015，42(7)：1299-1312.

[10]陈宝玲，甘桂云，王先裕，等. 126份番茄材料的抗性基因分子标记检测[J].中国蔬菜，2016(6)：34-41.

[11]杨欢欢，赵婷婷，刘 冠，等. 番茄黄化曲叶病抗病基因与抗病育种的最新进展[J]. 分子植物育种，2016，14(8)：2044-2049.

[12]李亚玲.番茄Mi-1基因SNP标记开发及种质资源的筛选[D].东北农业大学，2010.

[13]彭祥珍.番茄抗黄化曲叶病基因Ty-1的分子标记及种质资源筛选[D].东北大学，2012.

[14]吴丽艳，龚亚菊，黎志彬，等.樱桃番茄种质资源果实相关性状的多元统计分析[J].西南农业学报，2012，26(5)：1001-4829.

[15]李锡香，杜永臣，冯兰香，等. 番茄种质资源描述规范和数据标准[M]. 北京：中国农业出版社，2006.

[16]乔 宁，阎振鑫，尼秀梅，等. 番茄黄化曲叶病毒抗性检测DNA提取方法的优化及应用[J]. 中国蔬菜，2017 (1)：31-35.

[17]郑积荣，胡浅浅，王慧俐，等. 番茄育种材料对黄化曲叶病毒抗性鉴定及抗性基因检测[J]. 浙江农业学报，2015(6)：1015-1023.

[18]Je Min Lee, Chang-Sik Oh, Inhwa Yeam. Molecular in Tomato Markers for Selecting Diverse Disease Resistances Breeding Programs[J]. Plant Breed. Biotech,2015,3(4):308-322.

[19]朱明涛，孙亚玲，郑 莎，等. 分子标记辅助聚合番茄抗病基因育种[J]. 园艺学报，2010(9)：1416-1422.

[20]Hai Thi Hong Truong, HakSoon Choi1, Myoung Cheoul Cho,et al. Use ofCf-9 Gene-based Markers in Marker-assisted Selection to Screen Tomato Cultivars with Resistance toCladosporiumfulvum[J]. Hort. Environ. Biotechnol., 2011, 52(2):204-210.

[21]周 蓉，蒋芳玲，梁 梅，等. 基于表型性状的番茄品种评价和遗传多样性分析[J]. 西北农业学报，2012，21(9)：95-102.