魏 群，曹 珊

(河南中医药大学， 郑州 450046)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一个多因素共同参与的过程，可导致心脑血管疾病的发生。随着年龄的增加，AS逐渐加重，目前已确定其与血栓形成、血管壁脂质浸润、血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和黏附分子介导的炎症反应密切相关，但其确切的发病机制尚未完全阐明[1]。研究显示，同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)可诱导血管VSMC增殖及迁移，VSMC的异常增生与迁移是AS发生过程中重要的病理基础[2]。我院自研的丹参通脉方(丹参、川芎、葛根、三七)具有调节血脂、降低血清Hcy水平的作用[3]。本研究探讨丹参通脉方 Hcy诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响，旨在分析其作用机制，更好地为临床应用服务。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，雌雄不限，购自郑州大学实验动物中心(合格证号SCXK 20090001)。

1.2 药物及试剂

丹参通脉方为我院自制方，由丹参10 g、川芎5 g、葛根10 g、三七6 g组成，经100 ml水煮，残液旋转蒸、冻干后得到。丹参、川芎、葛根、三七均经我院鉴定。Hcy为Sigma公司产品(批号C-7352)； DMEM培养基和胎牛血清为四季青公司产品(批号20160315)；蛋白提取试剂盒为上海哈灵生物公司产品(批号20160205)；4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)为sigma公司产品(批号D8200)；其他试剂均为国产分析纯剂试剂。

1.3 主要仪器

超净工作台(AIRTECH，苏州净化设备有限公司)；精密电子天平(梅特勒-托利多)；电动移液器(德国Eppendorff公司)；Western电泳仪(美国伯乐)；Western转膜仪(美国伯乐)；低温高速离心机(Eppendorf 公司)；CytomicsTMFC 500系列流式细胞仪(美国贝克曼库尔特)；Transwell小室(Chemicon公司)；转膜仪(Bio-Red公司)。

1.4 VSMC原代细胞培养和鉴定[2]

采用组织贴块法培养SD大鼠胸主动脉VSMC，采用平滑肌肌动蛋白(SM-actin)免疫荧光鉴定 VSMC，并通过SM-actin与4’、 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染关系检测VSMC纯度，培养4～7 代后用于后续试验。

1.5 分组与给药

培养4～7 代的VSMC原代细胞调整细胞浓度为1×104/L，于24孔板加入细胞悬浮液，每孔细胞5×104个，细胞分为对照组、Hcy组(500 μmol/L Hcy)、丹参通脉方低剂量组(500 μmol/L Hcy+1 mg/L丹参通脉方冻干粉)、丹参通脉方高剂量组(500 μmol/L Hcy+10 mg/L丹参通脉方冻干粉)和瑞舒伐他汀组(500 μmol/L Hcy+1 mg/L瑞舒伐他汀)5组。

1.6 MTT法检测细胞增殖能力

采用MTT法检测细胞增殖活力。将对数期的细胞消化后，调整细胞浓度为1×104/mL，接种于96孔培养板，在37℃、50 mL/L CO2培养箱中孵育，至70%～80%细胞融合后各组相应加入药物。对照组加入等量培养基，每组设6个复孔，同时设定空白对照组，分别培养48 h。PBS冲洗培养板，随后加入MTT再培养4～5 h，弃上清加150 uL DMSO 溶解，于酶标分析仪490 nm波长处测各孔吸光度值，所得数值为各组值减去空白对照值，采用划痕法检测细胞迁移面积。

1.7 Transwell法检测VSMC迁移

取将对数期的细胞消化后各组相应加入药物，对照组加入等量培养基。各组24孔板配套的Transwell 小室下室加入10%胎牛血清的 DMEM培养基500 μL，上室加入200 μL 细胞悬液，分别培养4、8、12、24、48 h。结束后取下Transwell半透膜，PBS洗涤3 次，多聚甲醛固定，DAPI 染核后荧光显微镜下随机取5个视野，统计穿膜细胞数量。

1.8 Western-blotting检测NF-κB、CHOP和TRB3蛋白表达水平

将对数期的细胞消化后，调整细胞浓度为1×104/mL，接种于96孔培养板，在37℃、50 mL/L CO2培养箱中孵育，至70%～80%细胞融合后各组相应加入药物，对照组加入等量培养基。每组设6个复孔，分别培养48 h。裂解VSMC提取总蛋白，Bradford法测定样品的蛋白含量，12%的凝胶分离蛋白质，利用转膜仪(湿转)在100 V 1.5 h的条件下将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，脱脂奶粉封闭2 h，洗膜后与稀释的NF-κB、CHOP和TRB3单克隆抗体(1∶1 000)过夜结合，洗模后加入稀释的二抗，室温孵育60 min，BeyoECL Plus显色，凝胶成像和化学发光分析系统收集显色条带，运用 Quantity One 软件进行蛋白条带数据分析。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 VSMC原代培养及鉴定细胞图

图1显示，大鼠胸主动脉VSMCs培养7 d 后组织块周围有细胞爬出，细胞融合传代后呈典型“峰谷”状排列生长，SM-actin细胞免疫荧光鉴定VSMC细胞纯度>99%。

注：左：形态学观察(×100)；右：细胞免疫荧光鉴定(×200)图1 VSMC原代培养及鉴定细胞图

2.2 各组细胞吸光度值测定结果

图2显示，与对照组比较，Hcy组细胞 24、48 h OD值显著上升(P<0.05)；与Hcy组比较，丹参通脉方低剂量组、丹参通脉方高剂量组和瑞舒伐他汀组24、48 h OD值显著下降(P<0.05)，且丹参通脉方高剂量组显著低于丹参通脉方低剂量组(P<0.05)。

图2 各组细胞吸光度值测定结果

2.3 各组细胞迁移情况比较

表1显示，与对照组比较，Hcy组细胞迁移面积和穿透细胞数量显著上升(P<0.05)；与Hcy组比较，丹参通脉方低剂量组、丹参通脉方高剂量组和瑞舒伐他汀组迁移面积和穿透细胞数量显著下降(P<0.05)，且丹参通脉方高剂量组显著低于丹参通脉方低剂量组(P<0.05)。

表1 各组细胞迁移比较

注：与对照组比较：*P<0.05；与Hcy组比较：▲P<0.05；与丹参通脉方低剂量组比较：△P<0.05

2.4 各组NF-κB、CHOP和TRB3表达比较

表1显示，与对照组比较，Hcy组NF-κB、CHOP和TRB3表达水平显著上升(P<0.05)；与Hcy组比较，丹参通脉方低剂量组、丹参通脉方高剂量组和瑞舒伐他汀组NF-κB、CHOP和TRB3表达水平显著下降(P<0.05)，且丹参通脉方高剂量组显著低于丹参通脉方低剂量组(P<0.05)。

表2 各组NF-κB、CHOP和TRB3表达情况比较

注：与对照组比较：*P<0.05；与Hcy组比较：▲P<0.05；与丹参通脉方低剂量组比较：△P<0.05

注：a：丹参通脉方低剂量组；b： Hcy组；c：丹参通脉方高剂量组；d：对照组；e：瑞舒伐他汀组图3 Western-blotting检测NF-κB、CHOP和TRB3表达水平

3 讨论

动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)及其所导致的心脑血管疾病是当今人类死亡的首位原因。目前已确定与AS发生发展密切相关的因素主要包括血管壁脂质浸润、血栓形成、损伤后的生物连锁反应、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC) 克隆增殖以及各种黏附分子介导的炎症反应等，但其确切的病因至今尚未完全阐明。 因此，AS发生机制及治疗靶点已成为国内外学者研究的热点。众多研究表明，Hcy可通过诱导内质网应激(endoPlasmic reticulum stress, ERS)介导内VSMC损伤和凋亡，从而启动血栓形成，促进AS发生发展[4-6]。此外，Hcy还可通过活化NF-κB途径上调VSMC内组织因子的表达水平，促进VSMC增殖，并促进VSMC表型由收缩型向合成型转化[4-10]。因此，本研究中采用Hcy作为通过ERS/NF-κB网络通路诱导VSMC损伤和增殖的刺激因子。

丹参通脉方以活血化瘀、通脉止痛组方，方中包含丹参、川芎、葛根、三七等专走血分的药物，具有养血活血的作用。因此，目前临床中多将丹参通脉方用于对高血压并脑梗死、短暂性脑缺血发作、血瘀型下肢动脉硬化闭塞症、动脉粥样硬化和血栓闭塞性脉管炎等疾病的治疗，并取得了较佳的临床疗效。

VSMC位于动脉血管的中层，具有多种功能，根据其功能不同分为收缩型和合成型2种表型。在正常情况下处于非增生状态、内表面有完整的内皮细胞覆盖即为收缩型。当内皮细胞受损时，血液中的生长因子和细胞分裂因子通过平滑肌细胞表面的受体，激活细胞内与表型有关的信号传导系统，细胞由收缩型转变成合成型并移行至内膜迅速增生。而内膜的大量增生将形成肌源性泡沫细胞，这是动脉粥样硬化的重要病理学特征之一，因此抑制平滑肌细胞增殖是心血管疾病防治的重要手段。MTT和Transwell试验数据表明，Hcy可诱导VSMC的增殖和迁移，丹参通脉方具有抑制VSMC增殖和迁移的作用，且呈剂量依赖方式。VSMC位于动脉血管的中层，具有多种生物学功能，其主要功能是收缩血管，但当血管发生炎症反应激活细胞有关信号传导系统，VSMC可被激活、增殖和迁移能力增加[11]，因此丹参通脉方具有抑制Hcy诱导的VSMC增殖和迁移作用。董宜旋等[12]报道称，中药丹参主要有效成分丹参酮ⅡA，可以抑制由Hcy诱导的VSMC增殖和迁移。我们的前期研究显示，由丹参、川芎、葛根、三七组成的丹参通脉方在冠心病、脑动脉粥样硬化、脑血栓治疗方面效果显著，具有调节血脂、降低血HCY水平、抗AS等作用。陈芳等[13]报道称，丹参通脉方可有效干预颈动脉AS斑块的发生发展，具有较好的防治AS作用。既往研究证实，葛根素具有调节血脂、保护VSMC、拮抗高Hcy诱导VSMC异常增殖等良好的抗AS作用[14-16]。

VSMC的增殖和迁移受多个信号通路的调控，以往研究多集中于单个信号通路进行研究。由于AS发生是多基因互动的结果，因此本研究中以ERS/NF-κB 2条密切相关的网络通路综合调控为主线，对丹参通脉方抗AS分子机制进行分析。NF-κB信号通路的异常激活与AS疾病的发生密切相关。有研究发现，在AS病灶中的巨噬细胞、VSMC等多种细胞中NF-κB多度活化[17-18]。内质网是重要的细胞器之一，是蛋白质合成、加工和运输的主要场所，同时在类固醇激素合成和脂质代谢过程中具有重要作用。在多种因素刺激下，可导致内质网生理功能紊乱发生内质网应激[19-23]。长期的内质网应激则启动细胞凋亡。CHOP是内质网应激经典的标志物之一，其表达上调则激活细胞死亡途径，可介导细胞凋亡加重脑损伤[14]。TRB3蛋白是一种激酶类似蛋白，可与丝/苏氨酸蛋白激酶AKT结合，从而参与细胞凋亡过程。当发生内质网应激时，CHOP表达上调促进TRB3基因的表达[24-27]。因此，丹参通脉方可能是通过ERS/NF-κB发挥抑制Hcy诱导VSMC增殖和迁移的作用。