方捷迪，王晓星，李争艳，周 琴，易慕华

(三峡大学附属仁和医院病理科，湖北宜昌 443001)

骨组织是由黏多糖和一些蛋白质纤维构成的骨样组织和沉着于其中的无机盐形成的，是一种坚硬的结缔组织，包括细胞及细胞外基质。细胞随其发育阶段可分为骨祖细胞、骨母细胞、骨细胞、破骨细胞[1]，细胞外基质包括有机物和无机物，有机物中包括胶原纤维和无定形基质，无机物中主要为骨盐。脱钙是应用化学或物理化学的方法将骨组织成分中的钙盐与胶原纤维分离，弃去钙盐[2]，保留完整有机成分的一种方法。脱钙方法与脱钙液的选择与骨组织切片的制作质量有着密切的关系。骨组织在制片前必须用脱钙液将组织中的钙盐除去，才能制成4～5 μm厚的切片[3]。如果脱钙不完全，切片时不仅损坏刀刃，而且染色时组织易出现脱片等现象[4]。如果脱钙过度，会破坏组织结构，使组织抗原丢失，严重影响对送检标本的临床病理诊断[5]，因此选择合适的脱钙方法很有必要。脱钙液有无机酸(硝酸、盐酸、硫酸)和有机酸(醋酸、甲酸)两大类[6]，脱钙液是决定骨骼组织切片质量、染色效果的关键[7]。目前在临床病理脱钙中，有3种脱钙液较理想，本研究通过比较3种脱钙液的脱钙效果和染色制片质量，旨在选择一种最好的脱钙方法应用于临床骨组织脱钙。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取本院送检的骨肿瘤、病变骨及钙化组织标本15例，组织离体后即用10%中性缓冲甲醛溶液充分固定12～24 h。

1.2试剂及仪器 浓盐酸、硝酸、无水乙醇购自广东汕头西陇化工股份有限公司；甲酸、氯仿、苏木素、伊红、中性树胶购自珠海Baso公司；冰醋酸、二甲苯、甲醛购自武汉市中天化工有限公司。常州中威TSJ-QX型全自动封闭式组织脱水机，WB-3000型包埋机，徕卡2235型切片机。

1.3试剂配制 (1)改良Jenkins混合溶液：浓盐酸5 mL，冰醋酸5 mL，氯仿10 mL，无水乙醇70 mL，10%中性缓冲甲醛10 mL。(2)硝酸-甲醛液：甲醛10 mL，蒸馏水90 mL，纯硝酸20 mL。(3)甲酸-甲醛液：甲酸15 mL，甲醛5 mL，蒸馏水80 mL。(4)10%中性缓冲甲醛液的配制：蒸馏水1 000 mL，37%的甲醛溶液100 mL，磷酸二氢钠4 g，磷酸氢二钠6.5 g，用1 mol/L氢氧化钠调整pH至7.2～7.4。

1.4方法 (1)固定。组织要求及时充分固定，大块骨组织应锯开固定，用中性缓冲甲醛液固定时间不少于12～24 h。(2)取材。骨髓穿刺标本一般长约1 cm、直径0.05～0.1 cm，不需修块，可直接用滤纸包好脱钙。大块的骨肿瘤、病变骨、钙化组织根据标本的不同用骨钳或骨锯处理成1.5 cm×1.0 cm×0.2 cm的骨组织块。(3)脱钙及终点判断。①物理方法：随时观察脱钙情况，当组织块呈半透明状浮在液面上，手指按压柔软有弹性，用大头针可轻松刺入骨皮质表示脱钙完全。②化学方法：用吸管取脱钙液1 mL，加10%草酸钾1 mL摇匀，以草酸盐结晶不析出为脱钙终点。(4)脱钙后的除酸处理。脱钙完全后，标本用流水冲洗5 min，碳酸锂饱和水溶液5 min，冲洗3次；再流水冲洗10 min，即可进行常规脱水，染色时适当延长组织在苏木素中的时间，而在伊红停留的时间适当缩短，这样可以得到更好的对比度。

1.5观察指标 骨组织脱钙时间、骨组织、HE染色效果。

2 结 果

经上述方法比较得出：骨组织块经改良Jenkins液常温脱钙4 d左右脱钙完全，组织损伤小，常规制片效果好，切片平坦，薄厚均匀，镜下见组织结构完整，无皱缩、龟裂现象，细胞核呈蓝色，骨基质、纤维、软骨呈不同程度的红色，色泽鲜艳，对比度好。骨组织块在甲酸-甲醛脱钙液中72～120 h脱钙完全，组织损伤较小，切片结构完整，染色鲜艳均匀，对比度较好。骨组织块在硝酸-甲醛脱钙液中48～60 h到达脱钙终点，肉眼见组织稍发泡肿胀，颜色淡黄，切片容易出现刀痕；镜下见组织结构欠完整，胞核淡染着色弱，对比度欠佳。3种脱钙液脱钙时间的比较，甲酸-甲醛脱钙液>改良Jenkins脱钙液>硝酸-甲醛脱钙液。3种脱钙液脱钙效果的比较，硝酸-甲醛脱钙液>改良Jenkins脱钙液>甲酸-甲醛脱钙液。3种脱钙液对组织损伤的比较，硝酸-甲醛脱钙液>甲酸-甲醛脱钙液>改良Jenkins脱钙液。

3 讨 论

脱钙是骨组织制片中的必要环节，如若脱钙不彻底，则组织切片困难，染色时易脱片，镜下观察骨组织结构模糊，胞核皱缩，部分区域折叠卷曲，影响病理诊断的及时性和准确性[8]。寻找简便、快捷、有效的脱钙方法是骨组织病理学研究的重要课题之一。结合多年骨组织脱钙经验，笔者认为以下方面值得关注。

3.1骨组织的固定 骨组织及时、充分的固定不仅能保存良好的骨组织形态结构，而且能防止组织自溶腐败，阻止细胞内外的酶对蛋白质的分解作用、保存组织细胞的抗原性[9]。脱钙液中的酸对骨组织有不同程度的损伤，未固定的组织在酸性脱钙液中受到的损伤比已固定的组织大3倍，所以骨组织必须先固定后脱钙，或脱钙与固定同时进行，未经固定的骨组织不宜脱钙。

3.2脱钙时应权衡的因素 (1)尽量减少脱钙液对组织和细胞成分的损伤，保护组织微细结构。(2)能充分去除钙质，又不影响后续HE和IHC染色。(3)脱钙方法简单，试剂价廉易得，适当兼顾脱钙时间[10]。

3.3脱钙后的中和酸处理 常规硝酸脱钙后的组织一般需要流水冲洗10～12 h，费时又不环保，本文脱钙到达终点后先流水冲洗5 min，然后饱和碳酸锂水溶液处理5 min×3次，再流水冲洗10 min，只需短短30 min即完成整个除酸过程。具有以下优点：由于饱和碳酸锂水溶液是一种弱碱液，能很快渗入到组织细胞中中和酸，大大缩短了流水洗涤时间，经此改进除酸方法制成的切片对苏木素嗜染性强，效果稳定。

3.4脱钙液的选择 本科室近年来一直采用10%硝酸脱钙，主要是因为其脱钙能力强，脱钙时间短，但这也使骨组织的脱钙程度较难掌握，容易过脱，对组织造成损伤。硝酸在脱钙过程中会产生二氧化碳，气泡从组织中溢出会使结缔组织分离[11]，破坏组织结构。另外，硝酸处理组织后染色效果差，胞核不着色或着色浅，不均匀，对比度欠佳。甲酸又名蚁酸，其脱钙速度比硝酸慢，破坏组织的程度比硝酸轻，但脱钙时间稍长，疏松骨片需脱钙48 h，致密骨片需4～5 d，其中每3 d需更换新液1次[1]。所以迫切需要寻找好的脱钙方法取而代之。通过查阅文献，综合比较文献介绍的较为理想的3种脱钙方法，发现Jenkins复合脱钙液弃硝酸而选用盐酸，对组织损伤小，不会使组织膨胀，而是使组织略有收缩。骨组织块经此液脱钙后，切片完整，平坦均匀，无返砂现象。不足之处同样在于组织处理时间过长，脱钙完全约需要7 d左右。2015年初本科室摸索改良Jenkins原配方，争取缩短脱钙时间，实验中把盐酸的量由原来的4 mL增加为5 mL，冰醋酸由原来的3 mL也增加为5 mL，无水乙醇由原来的73 mL降为70 mL，氯仿及甲醛剂量不变，经过近50例骨组织块脱钙观察，组织处理时间大为缩短，骨密度高的如股骨组织块常温下72 h即可彻底脱钙，骨密度较低的骨松质36～48 h也能脱钙完全，若加急则可以将脱钙液放入37 ℃恒温箱中，骨组织块24 h左右即达到脱钙要求。此组合脱钙液中盐酸为强酸，增加盐酸用量旨在加快脱钙时间，同时又担心影响细胞核的着色，实际操作中观察发现，通过改善除酸方式，盐酸与生理盐水和氯仿混合后对细胞核的着色影响甚微，盐酸除了加快脱钙速度，还有使组织略收缩的功效，降低了冰醋酸对组织膨胀的影响[12]。由于骨组织的致密性，固定剂的选用要求具有强的穿透力，Jenkins复合脱钙液选用中性甲醛，甲醛具有穿透速度快、固定均匀、对组织收缩较小的特点，使得脱钙液不但具有脱钙作用，同时兼具较好的固定作用。冰醋酸具有在固定时穿透速度快，且有防止组织自溶变性的特点，同时还能使组织略膨胀，稍加量即可抵消盐酸及甲醛引起的组织收缩和硬化[13]。骨组织在改良Jenkins液脱钙彻底后切片光滑细腻，厚度可达4 mm，骨与骨周围组织形态保持完整，骨髓腔内的细胞清晰可见，胞质、胞核及骨小梁着色均匀，色彩鲜艳，对比度强，能较好地显示骨组织的各种结构，是一种较理想的用于临床病理工作的脱钙方法。

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