王晓清，袁国强，潘亚文,2*

(兰州大学第二医院 1.神经病学研究所； 2.神经外科临床医学中心，甘肃 兰州 730030)

Notch基因最早在1917年黑腹果蝇中发现，因其功能部分缺失造成果蝇翅膀边缘缺刻(notch)而命名。从果蝇残翅到人类肿瘤靶向治疗研究经历近100年，Notch信号通路在无脊椎动物和脊椎动物中广泛存在且高度保守，介导相邻细胞相互作用，调节细胞、组织及器官的分化和发育。哺乳动物中Notch途径的功能复杂多样，参与干细胞更新分化[1]、造血和T细胞发育等重要生理过程。Notch信号异常在肿瘤的进展中具有重要作用，最初在人类急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukaemia, T-ALL)中发现Notch信号遗传学改变，Notch1基因参与t(7; 9)(q34; q34.3)复发性易位，大约50%的人类T-ALL病例中存在Notch信号异常[2]。随之在实体瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、脑肿瘤和黑色素瘤等进展中均发现Notch信号通路异常。Notch信号中关键分子的基因突变、异常表达与多种肿瘤的发生进展密切相关，而且不同的Notch受体在肿瘤的发生发展过程中发挥着不同作用[3]。

1　Notch信号通路

1.1　Notch信号通路的组成

Notch信号通路包括Notch受体(Notch1-4)、Notch配体(delta-like 1、3、4和jagged1- 2，DSL蛋白)、转录因子(CSL)、相关调节因子和靶基因等。Notch受体由胞外区(NEC)、跨膜区(NTM)和胞内区(NICD)组成，是一种单次跨膜糖蛋白。胞外区含有36个EGF(epidermal growth factor)样重复序列和3个富含半胱氨酸的Lin Notch重复序列(LNR)，与配体结合并启动Notch；胞内区包含核定位序列(nuclear localization sequence, NLS)、1个RAM区、6个锚蛋白(ankyrin, ANK)重复序列、C端反式激活结构域(transactivation domain, TAD)和PEST序列。PEST序列为富含脯氨酸(proline)、谷氨酸(glutamic)、丝氨酸(serine)和苏氨酸(threonine)区域。其中RAM结构域是CSL结合区，两者可形成RPB-Jκ，ANK结构域是蛋白质相互作用的重要区域，TAD是转录激活域，PEST结构域与Notch受体的降解有关。Notch配体结构包含一个N端的胞外区、富含半胱氨酸的DSL(delta、serrate和LAG- 2)蛋白以及不同数量的EGF样重复区。

1.2　Notch信号通路的激活

Notch信号通路激活过程：1)在内质网合成一个无效的单链前体蛋白为Notch受体，随之在高尔基体内被Furin样转化酶裂解(S1)，产生含N末端胞外亚基和C末端跨膜片段，两者通过Ca2+依赖性的非共价键结合形成异二聚体，后被转运至细胞膜。2)Notch受体与配体结合，由金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase, ADAM)家族成员(ADAM17或ADAM10)催化切割(S2)，导致细胞外亚基解离，并产生与细胞膜相关的Notch胞外截短(notch extracellular truncation, NEXT)中间体。3)由早老素1/2(presenilin 1/2, PSEN1/2)、nicastrin、早老素增强子2(presenilin enhancer 2,PEN2)和APH1组成的γ-分泌酶复合体酶切释放Notch活性结构域(NICD)至细胞质中。4)NICD转移至细胞核中，通过RAM结构域及ANK重复序列与转录因子CSL (CBF- 1/RBP-Jκ)结合，募集SKIP(CBF1结合蛋白)、MAML(转录共激活因子)和 p300组成转录激活复合物，进而激活Notch靶基因的转录。Notch下游靶基因包括E/sp1、HES、HEY、细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、NRARP、NF-κB、MYC[4]和survivin[5]等。

2　 Notch信号通路与肿瘤的发生发展

2.1　Notch信号与白血病的发生发展

白血病是一类造血干细胞异常的克隆性恶性肿瘤。Notch信号传导失调涉及慢性B淋巴细胞白血病的进展，在超过50%的人类急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)和非霍奇金淋巴瘤的亚型中鉴定了Notch基因异常[6]。T-ALL患者中存在Notch1激活突变，异常Notch信号通路已经成为白血病细胞增殖和代谢的主要调控者，其中Notch1突变严格依赖于MYC上调[7]。研究者建立T淋巴细胞体外模型，发现Notch1和4直接促进c-MYC表达，进而增加survivin的丰度和T细胞分化，而c-MYC负表达则降低survivin水平并伴随早期T细胞分化延迟，Notch依赖性T细胞分化被survivin的减少而终止[8]，c-MYC和survivin可作为Notch信号调节T淋巴细胞从造血干细胞分化的重要介质。在胸腺细胞特异性过表达Dlx5(distall-less homeobox)基因的转基因小鼠模型中，鉴定Notch1/3和Irs2是Dlx5的直接转录靶标，Dlx5可直接反式激活Notch表达，在T细胞发育早期Notch1/3表达和Irs2诱导的Akt信号均上调[9]。另有报道Notch信号传导在慢性骨髓性白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)中的作用，评估慢性期CML患者和正常受试者骨髓的CD34+干细胞和祖细胞Notch及其下游靶标HES1的表达模式，发现Notch1在原代CML细胞CD34+群体内的不同淋巴和骨髓祖细胞中均有表达，Notch1/2和HES1在CML CD34+细胞CD34+Thy+亚型中显著上调，这表明在CML 原始祖细胞中Notch信号传导被激活[10]。

2.2　Notch信号通路与肺癌的发生发展

肺癌是导致全球人类死亡常见的肿瘤之一[11]。大约80%的肺癌患者被诊断为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)[12]。在小鼠Lewis肺癌(LLC)细胞中，Notch配体DLL3 mRNA水平随着肿瘤微环境刺激而改变，即在低氧条件或肿瘤坏死因子(TNF)-α刺激下降低。在体外LLC中DLL3过表达促进细胞增殖并减少凋亡，将Lewis肺癌细胞接种到小鼠体内时促进肿瘤生长，而且与癌旁组织相比，DLL3在人肺癌组织中高表达[13]。HES5是Notch途径下游激活的一种转录因子，调控多种组织的细胞分化，研究发现HES5表达上调与肿瘤较强侵袭性和不良预后呈正相关，而且HES5与STAT3直接相互作用，HES5的消耗导致STAT3磷酸化被抑制并降低下游基因的表达。体外血清饥饿法和HES5-siRNA转染实验证明HES5表达促进NSCLC细胞增殖，敲低HES5使细胞周期停滞在G0/G1期，克隆形成率降低并减少细胞凋亡[14]。Notch靶基因HES5可能通过STAT3信号传导促进NSCLC细胞的增殖。

2.3　Notch信号通路与乳腺癌的发生发展

乳腺癌是全世界女性常见的恶性肿瘤之一，占所有肿瘤病例的25%，病死率的15%[15]。利用慢病毒载体敲除Notch1，乳腺癌干细胞克隆球的数量、比例和穿透Transwell膜的细胞数均减少，同时植入裸鼠体内的肿瘤也变小。这表明Notch1信号与乳腺癌干细胞的行为密切相关，阻断Notch1信号能够抑制乳腺癌干细胞的恶性行为[16]。活化的Notch1信号通路激活NF-kB信号通路，进而上调NF-κB靶基因(MMP- 2/- 9、VEGF、survivin、Bcl-xL和细胞周期蛋白D1)的表达。Notch1信号通路在促进乳腺癌恶性表型中起重要作用，这可能部分是通过激活NF-κB信号通路来介导[17]。这提示靶向失活这些通路为治疗乳腺癌提供一种新的策略。近期研究发现不同表达水平的表皮生长因子样蛋白δ样同源物(DLK1)通过抑制Notch1信号反向调节人乳腺癌MDA-MB- 231细胞的致癌潜力，DLK1高表达导致Notch信号传导显著降低，进而降低乳腺癌细胞的增殖和侵袭。相反，由过表达的DLK1处于较低水平而导致Notch抑制也处于较低水平时，导致体外MDA-MB- 231细胞侵袭增加，体内外细胞大量增殖。这表明Notch信号的细微调节在控制乳腺癌细胞增殖和侵袭中起重要作用[18]。

2.4　Notch信号通路与胶质瘤的发生发展

脑胶质瘤是颅内常见的恶性肿瘤。Notch信号通路表达上调在维持脑肿瘤干细胞和侧群细胞(side population, SP)自我更新和化学耐药中起重要作用，RNA干扰敲低Notch1后，SP细胞的神经球形成能力和自我更新以及化学耐药性显著降低，同时SP干细胞表面基因Oct- 4、Sox2和Nanog的表达显著降低[19]。该研究表明Notch1的上调与胶质瘤的化疗抗药性和肿瘤复发有关。有学者分析4种不同Notch受体在3组不同来源的胶质瘤细胞培养物中的差异表达，这3组分别是胶质瘤细胞系，不同WHO分级的人胶质瘤活组织和新鲜切除的原发性胶质瘤，发现Notch受体表达与细胞分化之间具有相关性，Notch1和Notch4是分化和分化不良的胶质瘤细胞的标志物，这提示Notch受体可作为胶质瘤分级和可能的预后因素[20]。

2.5　Notch信号通路与其他肿瘤的发生发展

Notch通路靶基因HES1、HES5、HEY1和N1ICD在肝癌细胞中均高表达，与肝癌细胞的侵袭性迁移能力呈正相关，IL- 17单克隆抗体Secukinumab联合IL- 35能够阻断Notch信号通路，同时降低肝癌细胞的侵袭性迁移能力[21]。在胰腺癌中Notch通路异常激活，Notch配体Jagged1和Jagged2呈高表达，对种植肿瘤的裸鼠腹膜内连续施用喹诺霉素21 d后，显著抑制肿瘤的生长，肿瘤干细胞标志物和Notch通路蛋白表达显著降低[22]，这表明喹诺霉素是通过抑制Notch信号蛋白靶向胰腺癌干细胞的有效抑制剂。对Notch信号通路相关基因在人类口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)中的作用进行Meta分析，发现该相关基因均上调，体外γ-分泌酶抑制剂抑制Notch信号通路后显著降低OSCC细胞增殖，C-FOS mRNA表达相应降低[23]。这表明Notch信号在人类OSCC中失调，并在细胞增殖中发挥作用。此外，在结肠癌、黑色素瘤、皮肤癌和卵巢癌中均发现了Notch信号通路表达异常[24-25]。

3　结语

Notch传导是哺乳动物中一条复杂的信号通路，不仅参与肿瘤干细胞的分化、增殖和凋亡过程，而且Notch信号的细微调节对肿瘤的侵袭具有重要作用。该通路作为细胞增殖和代谢的重要调控者，紧紧依赖于肿瘤微环境和其他信号通路相互作用，针对不同肿瘤如何有效识别和靶向Notch相关的参与者和靶分子，对抗肿瘤治疗至关重要。未来靶向治疗肿瘤在药物抑制剂、单克隆抗体和基因水平等方面具有重大研究前景。