孙苏军，纪海玉，白 云，于 娟，冯莹莹，董晓丹，刘安军*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

坦洋工夫红茶是以来自福建福安茶树的芽叶为原料，经过萎凋、揉捻、发酵、干燥等典型工艺过程精制而成的全发酵茶类[1]，富含儿茶素、茶黄素和茶红素等多种抗氧化多酚物质及具有生物活性的碳水化合物等[2]。研究发现，氧化损伤可导致人体一些慢性疾病的发生，如癌症、心血管疾病和炎症等[3]。而红茶多酚体内外实验均表现出较强的抗氧化能力[4-5]，可降低多种疾病的发病率，增强机体的抗肿瘤能力[6]。红茶多糖是来源于红茶中的一种重要的功能性碳水化合物，因其良好的水溶性而更容易被机体消化吸收[7]，但目前关于红茶多糖提取工艺及生物活性的研究较少。

癌症治愈困难，致死率高，严重影响着人类的健康[8]。近年来，一些多酚类物质[9]和海藻硫酸多糖[10]表现出了优秀的抗肿瘤活性且无明显的副作用，而关于红茶多糖的抗肿瘤活性则需进一步探索。传统的茶多糖提取方法为水溶醇沉法[11-12]，提取过程中的液料比、提取温度、提取时间及浸提次数均会影响多糖得率。研究发现，不同产地和品种的茶叶中茶多糖的结构和活性也不相同，河东绿茶多糖具有免疫调节、抗肿瘤活性[13]，黄山绿茶多糖具有降血糖作用[14]，紫阳绿茶多糖具有抗疲劳活性[15]，普洱茶多糖具有抗氧化功能以及抑制α-糖苷酶作用[16]等。

鉴于目前对红茶的研究主要集中在其多酚化合物的抗肿瘤和抗氧化活性上，而对红茶多糖的提取工艺以及其抗肿瘤活性研究鲜有报道。因此，利用响应面法对红茶多糖的水溶醇沉提取工艺进行优化，并初步研究其在BALB/c小鼠体内抗肿瘤活性，为红茶多糖的进一步开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红茶：坦洋工夫红茶，产地福建福安。

实验动物：BALB/c小鼠40 只，雌性，体质量19～21 g，购于北京大学医学部（SCXK（京）2011-0012）。

试剂：无水乙醇购自天津市江天化工技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

SY-2000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司；真空冷冻干燥机、ST16R冷冻离心机 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 红茶多糖的提取工艺

工艺流程：红茶→清洗→热水提取→抽滤→上清液→减压浓缩→75%乙醇醇沉→离心→沉淀→无水乙醇洗涤→加水溶解→离心→水溶液→冷冻干燥→粗多糖。

操作要点：将红茶热水提取液抽滤后，收集上清液在旋转蒸发器上55 ℃浓缩至约40 mL，加入3 倍体积的无水乙醇进行醇沉，放置过夜后，混合物3 500 r/min离心15 min，收集沉淀。将沉淀用无水乙醇洗涤2 次，加去离子水溶解后弃去沉淀，将水溶液3 500 r/min离心15 min，收集上清液并将其冷冻干燥，得到红茶多糖。

1.3.2 多糖得率的计算

按照公式（1）计算多糖得率：

1.3.3 单因素试验

1.3.3.1 液料比对多糖得率的影响

在提取温度60 ℃条件下，分别以10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）的液料比提取60 min，浸提3 次。试验重复3 次，考察液料比对红茶多糖得率的影响。

1.3.3.2 提取温度对多糖得率的影响

以液料比20∶1（mL/g），分别在30、40、50、60、70 ℃温度条件下提取60 min，浸提3 次。试验重复3 次，考察提取温度对红茶多糖得率的影响。

1.3.3.3 提取时间对多糖得率的影响

以液料比20∶1（mL/g）、60 ℃条件下分别提取40、50、60、70、80 min，浸提3 次。试验重复3 次，考察提取时间对红茶多糖得率的影响。

1.3.3.4 浸提次数对多糖得率的影响

在提取温度60 ℃条件下，以20∶1（mL/g）的液料比提取60 min，浸提次数分别为1、2、3、4、5 次。试验重复3 次，考察浸提次数对红茶多糖得率的影响。

1.3.4 响应面试验

在上述单因素试验的基础上，选定液料比、提取时间与提取温度为自变量，多糖得率为响应值，根据Box-Behnken设计原理，采用三因素三水平响应面分析法进行试验设计，优化红茶多糖的提取工艺，因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验的因素与水平Table1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.5 红茶多糖纯化方法及结构分析

粗多糖水溶液通过反复冻融8 次，2 300×g离心20 min弃去沉淀，除掉蛋白、不稳定多糖等大分子物质，而后通过3 500 Da透析袋透析，除掉小分子杂质，冷冻干燥得到冷溶性多糖组分，经苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法分析多糖的总糖及蛋白含量，通过气相色谱和红外光谱分析多糖的单糖组成及结构特性。

1.3.6 红茶多糖体内抗肿瘤活性测定

将40 只BALB/c小鼠随机分为4 组，分别为空白对照组（灌胃10 mL/（kg·d）生理盐水）、模型对照组（灌胃10 mL/（kg·d）生理盐水）、红茶多糖低剂量组（500 mg/（kg·d））、红茶多糖高剂量组（1 000 mg/（kg·d）），每组10 只，灌胃15 d后，在除空白对照组以外的各组小鼠右腋下接种H22肿瘤细胞（2×106个/只），并继续灌胃21 d，每3 d记录一次小鼠质量，接肿瘤1 周后每天用游标卡尺测量肿瘤长度（L/cm）和宽度（W/cm），计算荷瘤小鼠实体肿瘤体积（V/cm3）并绘制其变化曲线图。按照公式（2）计算肿瘤体积：

实验期结束，对小鼠末次灌胃后，断粮12 h，断颈处死，解剖取小鼠脾脏、胸腺及肿瘤并称质量，按照公式（3）～（5）计算脾脏指数、胸腺指数及抑瘤率[17-18]：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对红茶多糖得率的影响

图1 液料比对红茶多糖得率的影响Fig. 1 Effects of solvent-to-solid ratio on the extraction yield of polysaccharide

由图1可知，在溶剂用量较小时，原料中的多糖不能够全部转移到溶剂中，造成提取不完全、多糖得率较低。增大溶剂用量可以使内部的植物细胞和外部溶剂之间产生更大的浓度差，有利于多糖更迅速地扩散溶出[19]。但溶剂用量过大时，多糖得率并没有继续升高，甚至有降低趋势，这可能是由于溶液浓度过低，致使后续的浓缩和沉淀工艺难度加大，操作步骤增多，造成部分多糖的损失，导致多糖得率下降。考虑到节约能源，选择30∶1（mL/g）左右的液料比比较合适。

2.1.2 提取温度对红茶多糖得率的影响

如图2所示，随提取温度的升高，红茶多糖的得率呈先上升后下降的趋势，其中在30～60 ℃之间提取率显著提高，60 ℃时达到最大值。随着提取温度的升高，多糖的扩散系数增大，使水溶液中多糖的含量增加。然而，温度过高可造成多糖的降解[20]，导致多糖得率降低，同时增加了能源消耗。因此，提取温度选在60 ℃左右。

图2 提取温度对红茶多糖得率的影响Fig. 2 Effect of temperature on the extraction yield of polysaccharide

2.1.3 提取时间对红茶多糖得率的影响

图3 提取时间对红茶多糖得率的影响Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharide

从图3可以看出，在40～70 min的提取时间范围内，多糖得率明显上升，在70 min时达到最大，之后提取时间的延长反而导致多糖得率下降。这是因为提取时间的延长可使多糖溶出到溶剂中变得更简单迅速[20]，但提取时间过长也会导致多糖的降解，使其得率降低[21]。因此，提取时间应控制在70 min左右。

2.1.4 浸提次数对红茶多糖得率的影响

图4 浸提次数对红茶多糖得率的影响Fig. 4 Effect of number of extractions on the extraction yield of polysaccharide

由图4可以看出，浸提3 次时，多糖得率达到最高，且继续增加浸提次数时，多糖得率也不再有明显的变化。说明浸提次数越多，能源消耗越大，且浓缩时的多糖损耗也会增加[22]。因此选择浸提3 次。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果与方差分析

通过单因素试验发现，当液料比30∶1（mL/g）、提取温度60 ℃、提取时间70 min、浸提3 次时，能够得到红茶多糖最大得率。如表2所示，将液料比、提取温度和提取时间作为研究因素，以红茶多糖得率为响应值，共得到17 个试验点，其中12 个为析因点，1 个为中心点，中心点试验进行5 次，用来估计误差。运用Design-Expert 8.0软件进行二次多元回归拟合，得到二次多元回归方程：Y=10.14-1.55A＋0.71B-0.28C＋0.014AB＋0.65AC-0.33BC-1.79A2-1.98B2-1.56C2。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table2 Box-Behnken design with experimental results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance of regression model

对红茶多糖提取的回归数学模型进行方差分析，以检验方程的有效性和各因子的偏回归系数，由表3可知，该试验选用的模型极显著（P＜0.01），方差的失拟项不显著（P=0.131 4＞0.05），说明非试验因素对试验结果的影响不大。另外，所选模型的决定系数R2值为0.974 5，这表明该模型与实际试验拟合较好，校正后的决定系数值为0.941 8，与R2值接近，说明了模型有充分的准确性和通用性。从表3还可以看出，A、B、A2、B2、C2对多糖得率影响极显著（P＜0.01），交互项AC对多糖得率影响显著（P＜0.05）；其他因素的影响不显著。

2.2.2 交互作用结果分析

图5 各因素交互作用的响应面和等高线图Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of variables on the extraction yield of polysaccharide

如图5所示，通过对以上3 个交互作用的分析可以预测和检验变量的响应值以及确定变量之间的相互关系[23]，响应面曲线越陡，反映出各因素之间的两两交互作用越显著。同样，等高线的形状也可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反[24]。通过响应面的陡峭程度分析发现，液料比对红茶多糖得率的影响最大，其次是提取温度和提取时间，且只有液料比和提取时间交互作用显著，这与方差分析结果一致。

2.3 验证实验结果

通过Design-Expert 8.0软件分析，得到红茶多糖提取的最佳条件为液料比27.64∶1（mL/g）、提取时间69.73 min、提取温度61.1 ℃，红茶多糖的提取率达到10.56%。考虑到实际情况对上述条件进行修正，最终的优化条件为液料比30∶1（mL/g）、提取温度60 ℃、提取时间70 min，在此条件下进行3 次平行实验验证，得到多糖得率为（10.52±0.21）%，与理论预测值较接近，说明用该模型对红茶多糖的提取进行工艺优化具有一定的实际可操作性。

2.4 红茶多糖成分及结构分析

2.4.1 红茶多糖主要成分及单糖组成

表4 红茶多糖主要成分及单糖组成Table4 Major components and monosaccharide composition of black tea polysaccharide

如表4所示，经冻融透析纯化后红茶多糖的总糖质量分数达76%，而蛋白质却仅含2%。单糖组成分析发现在红茶多糖中阿拉伯糖和半乳糖醛酸含量最高，质量分数分别达34%和30%；其次为葡萄糖和半乳糖，所占比例为14%和13%；岩藻糖和鼠李糖含量最低。

2.4.2 红茶多糖红外光谱分析

图6 红茶多糖红外光谱分析Fig. 6 FT-IR spectra of black tea polysaccharide within the range of 4 000–400 cm－1

由图6可以看出，红茶多糖在3 423.67、2 931.34、1 733.81、1 643.81、1 407.57、1 248.04、1 076.45、601.44 cm-1均表现出较强的吸收峰。红茶多糖在3 423.67 cm-1处的谱峰表示O—H基团的伸缩振动，2 931.34 cm-1归属于C—H伸缩振动和弯曲振动[25]，1 733.81 cm-1和1 407.57 cm-1处的吸收峰则表示有羧基和羰基的存在[26]，表示含有糖醛酸，而在500～900 cm-1处的吸收峰则表示该多糖含有吡喃环[27]。结果表明该多糖为含有吡喃环和糖醛酸，与上述数据一致。

2.5 红茶多糖体内抗肿瘤活性检测结果

2.5.1 各组小鼠体质量变化

图7 各组小鼠体质量变化Fig. 7 Changes in body weight of mice in all groups

各组小鼠适应环境1 周后，开始灌胃给药，灌胃14 d后接种H22肿瘤细胞。由图7可知，各组小鼠体质量在接种肿瘤细胞前无明显差异，均无明显的消瘦现象及由于药物引起的病变及中毒现象[28]，体质量稳定，说明红茶提取物对小鼠无不良影响，而后期由于实体肿瘤的生长导致荷瘤小鼠体质量偏大。

2.5.2 荷瘤小鼠实体肿瘤体积变化

图8 荷瘤小鼠实体肿瘤体积变化Fig. 8 Changes in tumor volume in H22 tumor-bearing mice

如图8可知，在接种H22肿瘤细胞第8天开始，模型组小鼠的肿瘤体积大幅度增大，多糖灌胃组小鼠肿瘤体积虽然也呈上升趋势，但是增幅缓慢，部分多糖组小鼠的肿瘤甚至出现先增长后萎缩的趋势。结果表明，红茶多糖对体内实体肿瘤的生长有明显的抑制作用。

2.5.3 脏器指数及抑瘤率

表5 红茶多糖对荷瘤小鼠免疫器官及肿瘤的作用Table5 Effects of black tea polysaccharide on immune organ indexes and tumor growth inhibition in tumor-bearing mice

脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官，脾脏和胸腺指数是反映动物机体免疫功能最基本也是最常规的指标，已被广泛应用于评价机体的整体免疫状态[29-30]。实验期结束后，对荷瘤小鼠进行解剖，称取各组小鼠的脾脏、胸腺和实体肿瘤，计算得出相应的脾脏指数、胸腺指数和抑瘤率，如表5所示。与空白组相比，模型组荷瘤小鼠的脾脏明显肿大（P＜0.01），胸腺严重萎缩（P＜0.05），而灌胃多糖组小鼠的脏器指数较模型组均有明显的改善，更接近正常组。结果表明，肿瘤细胞的恶性增殖严重损害了模型组小鼠的免疫系统；而红茶多糖可显著抑制体内肿瘤细胞的增殖，有效地保护了小鼠的脾脏和胸腺，且呈剂量相关性，高剂量组（1 000 mg/kg）小鼠的抑瘤率可达66.30%。

3 结 论

以红茶多糖得率为考察指标，通过单因素试验和响应面分析法获得红茶多糖最优提取条件为液料比30∶1（mL/g）、提取温度60 ℃、提取时间70 min，红茶多糖得率达10.52%，经纯化后多糖质量分数达76%，主要由阿拉伯糖（34%）、半乳糖醛酸（30%）、葡萄糖（14%）、半乳糖（13%）、岩藻糖（5%）和鼠李糖（4%）组成，红外光谱分析也表明其含有糖醛酸和吡喃环结构。抗肿瘤动物实验研究结果表明，红茶多糖可显著保护荷瘤小鼠脾脏和胸腺，并抑制其体内实体肿瘤的生长，且呈剂量相关性，高剂量组（1 000 mg/kg）小鼠的抑瘤率可达66.30%。

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