冯 龙，马云云，曹 珊，李晓娟，王媛媛，陈肖楠，孙倩倩，吴建博，赵国强

1)河南中医药大学基础医学院病原生物学与免疫学科 郑州 450046 2)河南医学高等专科学校微生物与免疫学科 郑州 451191 3)河南中医药大学基础医学院方剂学科 郑州 450046 4)郑州大学基础医学院病原生物学与免疫学科 郑州 450001

荧光素酶报告基因系统是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法，具有灵敏度高、特异性好、检测时间短等特点，而且对所测定的活体没有任何毒性[1-2]。pGL4.10为Promega公司构建的荧光素酶报告基因载体，含有萤火虫荧光素酶报告基因(Firefly)，可用作定量分析哺乳动物基因表达的工具[3]。但由于pGL系列载体中只含有Firefly，因此使用中无法排除本底因素的干扰，容易产生检测误差。我们将海肾荧光素酶报告基因(hRLUC)克隆入pGL4.10载体中，构建双荧光素酶报告基因表达载体pGL4.10-hRLUC，该载体能够同时表达Firefly 和hRLUC，并以hRLUC作为内对照，这样就为实验检测提供了一条基准线，减小了细胞活性和转染效率对实验结果的影响[4]，从而提高了检测结果的稳定性和可靠性。现将构建过程报道如下。

1 材料与方法

1.1材料HEK293细胞株购于中国典型培养物保藏中心，用含体积分数10% 胎牛血清的DMEM细胞培养基进行常规培养。DH5α为本实验室保存。pGL4.10质粒、pmirGLO质粒、pGEM-T 载体、E1960荧光检测试剂盒均购于Promega 公司。TaqDNA聚合酶，Pfu高保真酶，限制性内切酶SalⅠ、XhoⅠ和NheⅠ，T4 DNA连接酶均购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自AxyGene 公司。G418和Lipofectamine3000购自Invitrogen公司。引物合成及序列分析均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3hRLUC表达单元的扩增以pmirGLO载体为模板，以R1、R2为引物进行PCR扩增，获得hRLUC表达单元。反应体系：10×buffer 3 μL，4×dNTPs 2 μL，R1、R2 各0.5 μL，Pfu高保真酶0.5 μL，ddH2O18.5 μL，模板DNA 5 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性 45 s，55 ℃退火55 s，72 ℃延伸90 min，30个循环；72 ℃末延伸10 min。产物经15 g/L凝胶电泳，回收hRLUC表达单元并纯化。

1.4pGL4.10-hRLUC的构建用T4 DNA连接酶将hRLUC表达单元与pGEM-T载体连接，获得重组载体pGEM-T-hRLUC，将其转化入感受态细菌DH5α，并进行氨苄青霉素筛选。随机筛选6个阳性菌落，分别以菌落裂解产物为模板，以T7/SP6为引物，进行PCR。用限制性内切酶SalⅠ分别对pGEM-T-hRLUC和pGL4.10进行单酶切，并对双粘pGL4.10进行去磷酸化处理，再用T4 DNA连接酶将hRLUC表达单元与磷酸化的pGL4.10进行连接，转化入感受态细菌DH5α。挑选阳性克隆，用SalⅠ酶切鉴定插入方向并进行DNA测序，获得双荧光素酶报告基因表达载体pGL4.10-hRLUC。

1.5pGL4.10-hRLUC的表达鉴定首先将HEK293细胞接种于24孔pGEM-T载体板，37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养24 h，当细胞汇合度达到80%时分组处理。pGL4.10-hRLUC组、pGL4.10组利用Lipofectamine3000转染相应质粒， 6 h后更换含有体积分数10%胎牛血清的DMEM完全培养基继续培养24 h，然后用含G418 800 mg/L的DMEM培养基进行筛选培养，每2～3 d 换液1次。挑选阳性克隆，维持G418质量浓度为200 mg/L扩大培养。用PBS洗涤细胞3次，参照E1960荧光检测试剂盒说明书，先加入裂解液裂解细胞，用Berthold Centro XS3 LB 960荧光检测仪检测细胞的相对荧光值。以未转染细胞作对照。每组设5个复孔。

1.6统计学处理应用SPSS 17.0进行数据分析。3组相对荧光值的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1hRLUC表达单元扩增结果以pmirGLO载体为模板，以R1、R2为引物进行PCR，扩增结果见图1，在2 350 bp处可见目的条带，与预期结果一致。

M:Marker;1:hRLUC表达单元图1 hRLUC表达单元的PCR产物电泳图

2.2pGEM-T-hRLUC的鉴定结果pGEM-T-hRLUC经转化、菌落筛选、PCR鉴定，证实含有hRLUC片段，见图2。

2.3pGL4.10-hRLUC的酶切鉴定结果经SalⅠ酶切鉴定，证实pGL4.10-hRLUC为正向插入克隆。经DNA测序分析，证实pGL4.10-hRLUC质粒序列与hRLUC表达单元序列完全一致。见图2。

M:Marker;1～3:hRLUC表达单元;4:pGL4.10-hRLUC反向插入；5：pGL4.10-hRLUC正向插入图2 pGEM-T-hRLUC的PCR 产物电泳图(左)及SalⅠ酶切鉴定结果(右)

2.4 3组细胞相对荧光值的比较未转染组、pGL4.10组、pGL4.10-hRLUC组细胞相对荧光值分别为(0.201±0.001)、(220.311±2.082)、(20.733±1.011)，3组比较差异有统计学意义(F=41.400，P<0.001)，两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

pGL4.10载体为荧光素酶报告基因表达载体，含有Firefly，能够用于定量分析基因表达[5]。但由于Promega公司的pGL系列载体中只含有Firefly，因此无法消除实验过程中细胞活性或转染效率对实验结果的影响。已有研究[6]证实Firefly和hRLUC基因没有种源同源性，两者对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。因此，如果将Firefly作为报告基因，以hRLUC作为对照基因，构建双报告系统，可以减少外部干扰，提高系统检测的敏感性与可靠性。

据此，我们利用分子生物学技术将hRLUC基因插入到pGL4.10载体中，构建了能够同时表达Firefly和hRLUC的表达载体pGL4.10-hRLUC。将pGL4.10和pGL4.10-RLUC分别转染入HEK293细胞，G418筛选获得稳定转染细胞株，采用Dual-Luciferase®双荧光素酶报告基因检测系统，测定相对荧光值。结果显示，pGL4.10-RLUC组细胞的相对荧光值较pGL4.10组明显降低，证实表达载体中的hRLUC表达单元能够正常工作，说明pGL4.10-hRLUC构建成功并能够正常表达。该载体可将hRLUC作为内对照，为检测提供一条基准线，提高实验数据的可信度。

[1] MARIN M,DU Y,GIROUD C,et al.High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors[J].Assay Drug Dev Technol,2015,13(3):155

[2] 罗天霞,樊红琨,芮丹丹,等.SK2和JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达[J].郑州大学学报(医学版),2016,51(5):580

[3] 温晓梨,孙宏卫,欧小利,等.小鼠DUSP1 3’-UTR双荧光素酶报告基因表达系统的建立及功能鉴定[J].解放军医学杂志,2013,38(4):265

[4] 杨卫红,闫良,刘利娥,等.双荧光素酶报告基因系统检测 CYP3A4*1G 增强 CYP3A4表达的调控作用[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(6):765

[5] ZHUKOVSKY MA,LEE PH,OTT A,et al.Putative cholesterol-binding sites in human immunodeficiency virus (HIV) coreceptors CXCR4 and CCR5[J].Proteins,2013,81(4):555

[6] 张仁,张圣洁,张学研,等.CLPTM1L与miR-494靶向关系的双荧光素酶报告实验验证靶向关系的双荧光素酶报告实验验证[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(3):430