陈秋秋+刘海霞+肖朋

[摘要]目的：观察不同静水压力作用下大鼠颞下颌关节髁突软骨细胞TRPM7和Fas蛋白的表达情况，探讨不同静水压力可能对软骨细胞凋亡的影響。方法：将软骨细胞随机分组，分别给予不同大小和时间的压力刺激。Western Blot检测每组TRPM7和Fas蛋白量。结果：加压时间为1h、2h时，6～10kPa实验组的Fas蛋白量均低于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05；当压力值为20kPa/2h、30kPa/1h或2h时，实验组高于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05；当压力为20kPa/1h时，实验组高于对照组，差异无统计学意义，P>0.05。加压时间分别为1h、2h时，6～20kPa实验组的TRPM7蛋白量均低于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05；当压力值为30kPa/2h时，实验组高于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05；但压力值为30kPa/1h时，实验组高于对照组，差异无统计学意义，P>0.05。结论：较小压力范围内，可能抑制软骨细胞的凋亡；压力条件超过一定界限后，可能对软骨细胞凋亡有促进作用。

[关键词]颞下颌关节；软骨细胞；静水压力；凋亡

[中图分类号]R782.6 [文献标志码]A

[文章编号]1008-6455（2017）07-0044-04

在颞下颌关节的一些疾病中，存在以髁突软骨细胞（mandibular condylar cartilage cells，MCCs）凋亡过度而致软骨细胞层变薄为特征的退行性变化，可能与关节内压异常增大有关。前期研究发现大鼠应激状态下咬肌肌肉异常活动度的大小与颞下颌关节组织病理改变存在正相关关系，即肌肉异常牵引力度越大，关节病变越严重。也有研究表明颞下颌关节对负荷首先表现为细胞的增殖，其中以软骨细胞最为活跃，随负荷增加，损伤过程大于修复过程，出现软骨基质的进行性破坏。目前，关节内压可能引起髁突软骨细胞凋亡的体外实验成为国内外基础研究的热点，本研究旨在通过对髁突软骨细胞施加不同时间和大小的静水压力，观察TRPM7和Fas蛋白的表达变化，探讨不同静水压力可能对软骨细胞凋亡产生的影响。

1材料和方法

1.1材料：PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天），30%丙烯酰胺、TEMED、SDS上样缓冲液（Amreseo），电转液（西格玛奥贸易有限公司），蛋白marker（14-120KD）（北京全氏金生物技术有限公司），蛋白marker（10-250KD）（fermentas），PVDF膜（0.45um）（Millipore）、兔抗GAPDH 37KD（杭州贤至生物有限公司），兔抗TRPM7 213KD（abeam），兔抗FAS 48KD（Santa Cruz），HRP标记羊抗兔二抗（LTD），ECL底物液（Thermo），X光胶片（柯达），显影定影试剂盒（武汉巴菲尔生物）。

1.2方法

1.2.1制备MCCs：无菌条件解剖大鼠下颌骨，眼科组织剪剖离髁突软骨并剥离软骨表面的纤维被膜，然后将软骨切成1mm×1mm×1mm大小组织块，0.2%Ⅱ胶原酶避光消化18～20h，获取MCCs。而后制备细胞悬液接种于100mm培养皿中，“+”铺匀，待细胞长满皿底80%左右时进行传代。

1.2.2施加静水压力：参考Ryuichi Kunii等的加压方法，取生长良好的第3代细胞，待生长达对数期时，随机分为两组，Fas组和TRPM7组。采用加压气囊装置向培养瓶内充气至压力表指针达到要求的压强强度，立即移入培养孵箱并计时。加压时间设置为1h、2h，每时间点给予OkPa、6kPa、8kPa、10kPa、20kPa、30kPa的压力，以OkPa作为对照。每组每压力条件下设置4个复孔，当加压结束后，立即收集细胞用Western Blot检测蛋白，每孔重复测量3次。

1.2.3蛋白样品的制备：①提取细胞总蛋白：倒净培养液，每瓶加3ml预冷的PBS（4℃）洗涤细胞3次，弃PBS后把培养瓶置于冰上，加400μ裂解液/瓶，冰上裂解30min，收集细胞碎片和裂解液，4℃下12000rpm离心5min，0.5ml的离心管分装离心后的上清，-20℃保存；②蛋白浓度的测定：稀释蛋白样品和BSA标准品，用DG一3022A酶标仪测定0D568，根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度；③蛋白变性：将提取的蛋白上清与5x蛋白上样缓冲液，放入沸水中进行沸水浴10min。

1.2.4电泳分离实验：①配制电泳胶：12%分离胶（总体系20m1）、8%分离胶（总体系20m1）、浓缩胶5%（总体系6m1）；②电泳分离：将制备好的胶固定到电泳槽上，储液池中倒入电泳液，将制备好的蛋白样品和MAKER加入上样孔，各样品总蛋白量为40μg，行电泳分离。

1.2.5电转移实验：转膜仪内放好夹紧板后的黑色板—纤维垫—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—纤维垫—白色板，黑色板对应黑色负极，加满电转液开始转膜。

1.2.6免疫印迹显色：采用ECL显色系统。将PVDF膜浸泡于TBST中，室温摇床封闭2h，将PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。洗去一抗加入二抗，37℃摇床孵育2h。TBST充分洗涤PVDF膜，以便洗去二抗，滴加工作液于PVDF膜上，待荧光带明显后，覆上保鲜膜，X光胶片压片后行显影和定影，冲洗胶片。

1.2.7蛋白表达量测定：晾干后扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值，以抗大鼠GAPDH作为内参，Fas/GAPDH和TRPM7/GAPDH作为蛋白相对表达量。

1.3统计学分析：采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，不同压力时间下，组内进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。endprint

2结果

不同压力条件下Fas和TRPM7，总蛋白各有一条灰色条带，灰度值不同，加压1h、2h后，检测各组蛋白含量。

2.1 Fas蛋白表達量测定结果：①随着压力值的增大，Fas蛋白表达呈先下降后增高趋势，见图1～2；②当静水压力为6kPa、8kPa、10kPa，实验组每组蛋白量均低于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05；③当静水压力为20kPa/2h、30kPa/1h、30kPa/2h时，实验组蛋白量均高于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05；④但20kPa/1h时，实验组的蛋白量与对照组比较差异无统计学意义，P>0.05。见表1。

2.2 TRPM7蛋白表达量测定结果：①随着压力值的增大，TRPM7蛋白表达呈先下降后增高趋势，见图3～4；②当静水压力为6kPa、8kPa、10kPa、20kPa，实验组每组蛋白量均低于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05；③当静水压力为30Kpa/2h时，实验组蛋白量均高于对照组，差异具有统计学意义，P<0.05；④但30kPa/1h时，实验组的蛋白量与对照组比较差异无统计学意义，P>0.05。见表2。

3讨论

颞下颌关节紊乱病（Temporomandibular disorders，TMD）是多种致病因素共同作用所致的一组疾病的总称，共同作用因素包括原始因素、始动因素（诱因）和持续作用因素。近年来国内外研究着重于强调行为和社会心理因素对TMD的影响。有研究表明当压力负荷过大或者持续过久时，可对关节软骨造成损伤，单一或反复的损伤是引起骨关节炎的始动因素。前期研究发现精神压力对TMD病变可产生影响，其可能机制是精神紧张引起全身肌肉收缩，进而将力量传递给下颌骨（articulatio mandibularis，OR），增加颞下颌关节（Tempromendibular Joint，TMJ）腔内压力，造成软骨病变。髁突软骨退行性病变是TMD的病理改变之一，髁突软骨细胞作为髁突软骨唯一细胞成分，其增殖和凋亡直接影响TMJ的生理病理状态。有相关实验表明力学刺激对软骨细胞的生长分化起着重要作用，也有学者利用不同静水压力施加于TMJ滑膜细胞，发现静水压力达到或超过一定范围时大鼠颞下颌关节滑膜细胞出现线粒体肿胀、胞质空泡样变等超微结构改变，并出现类似包涵体的凋亡小体，且变化程度随压力增大而加重，推测其机制可能与压力激活凋亡基因有关。本实验通过模拟软骨细胞体内生存环境，观察不同静水压力作用下Fas和TRPM7蛋白表达情况，从而探究压力作用下软骨细胞凋亡可能存在的变化规律。

Fas又称Apo-1，是存在于细胞膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，Fas与其相应的配体结合后可传递一种细胞凋亡信号，诱导细胞发生凋亡的一系列生化反应或形态学改变。Fas及配体也是近年来研究细胞凋亡最为热点的膜表面分子，故研究探讨其在细胞凋亡中的变化对阐明TMD病理机制具有深远意义。Fas基因是公认的凋亡活化基因，在凋亡活化阶段发挥重要作用。Fas及配体在关节软骨中高表达，故Fas途径常被认为是软骨细胞凋亡途径之一。王拥军等人。也证实了Fas通路能诱导体外培养的髁突软骨细胞发生严重凋亡。本研究在压力时间为1h、2h时，6～10kPa组的Fas蛋白较0kPa组低，且差异有统计学意义。该结果提示软骨细胞凋亡在较小压力条件下可能是呈抑制状态的。这与张曼等人的研究结果即力学刺激对髁突软骨细胞的生物学反应具有重要意义，也可能是髁突保持终生改建能力的重要生物学基础之一相一致。同时，适度的负重对维持关节的正常结构、功能和生理改建是必须的，具有重要意义。这一观点与本研究结果也相符。当压力值为20kPa/1h时，实验组与0kPa组无统计学差异，但当压力值不变，时间延长为2h，实验组蛋白高于0kPa组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。当加压时间为1h不变，延长压力时间为30kPa时，实验组蛋白又高于0kPa组，且差异具有统计学意义（P<0.05）。本结果表明当压力值和/或时间超过一定界值时可抑制Fas蛋白的表达，即过度的压力刺激可能促进软骨细胞凋亡。本实验结果支持王世东的观点，即健康状态下的关节软骨可以承受一定时间和一定强度的外力，一旦超过一定强度或时间，可对关节软骨造成损伤，损伤程度与力的大小、类型、程度及持续时间有关。

TRPM7（transient receptor potential melastatin-7）是存在于细胞膜上的压力敏感通道，参与多种生理功能，包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡及细胞死亡等，近年来对其研究较为深入。TRPM7通道在2003年被Arts证实：在缺糖缺氧条件下，该通道在神经元死亡过程中起重要作用。该通道可能也在软骨细胞凋亡机制中起到重要作用。本研究在压力值为1h、2h时，6～20kPa组的TRPM7蛋白较0kPa组低，且差异有统计学意义。提示较小的压力条件可能对软骨细胞的凋亡有抑制作用。压力值为30kPa/1h时，两组比较无统计学差异，但当时间调整为2h时，实验组比0kPa组蛋白量高，差异具有统计学意义P<0.05。提示该压力条件下，软骨细胞凋亡可能是增长的。上述实验提示我们一定压力负荷内，可抑制软骨细胞TPPM7蛋白表达，当压力超过一定界值后，该蛋白表达增加。这与Fas蛋白表达变化规律基本一致，我们推测TRPM7也可能参与了压力作用下MCCs的凋亡。

4结论

本次研究根据体外培养的髁突软骨细胞在不同条件静水压力下，观察软骨细胞Fas和TRPM7蛋白变化规律，探讨了不同压力可能与髁突软骨细胞凋亡之间的关系：①适当压力范围时，可抑制Fas蛋白和TRPM7蛋白的表达，有可能与软骨细胞凋亡受抑制有关；②压力超过一定范围后，Fas蛋白和TRPM7蛋白表达均上调，有可能与软骨细胞凋亡增加有关。即Fas通路和TRPM7通路都有可能参与髁突软骨细胞凋亡，但仍需进一步实验证实此结论。这或许为TMD的临床防治提供思路。endprint