封 婕 高玲娟 许豪勤 吴玉璘 林 宁 闫林萍1, 综述 钟天鹰* 审校

1. 南京医科大学第四临床医学院(210004)；2. 江苏省南京市妇幼保健院；3.江苏省计划生育科学技术研究所

宫颈癌是世界范围内排名第4位的女性常见癌症，被认为与高危型人乳头瘤病毒( HPV)的感染密切相关[1-2]。高危型HPV可以通过性传播途径感染，至少有15个基因型，而HPV 16是其中最常见的致癌类型，被发现存在于全世界大约50%的侵入性宫颈肿瘤中[3]。目前，针对HPV感染已有预防性疫苗出现，并预期降低宫颈癌的发生率，但晚期或者复发的宫颈癌患者预后仍然较差，其死亡率也依然较高。对于无法进行手术治疗并且已接受过放射治疗的晚期或者复发的宫颈癌患者来说，通常的治疗方法是铂类化疗[4]。最近，也有文献报道大剂量贝伐单抗化疗能延长晚期或者复发宫颈癌患者的生存时间[5]。但是，这种二线疗法的优势还没有被证实。因此，开发HPV的治疗性疫苗并用来治疗HPV感染导致的宫颈上皮内损害以及宫颈癌有着重要意义。

1 HPV的结构特点及E6、E7蛋白致癌作用

HPV是一种无包膜的微小DNA 病毒，直径约52～60nm，为二十面体对称的核衣壳结构。目前，已鉴定出200余种HPV亚型,其中仅少数几种能够致癌[6]。HPV包含一条单向转录的闭环双链DNA ，约含8000个核酸碱基对(bp)，按功能分为 3个区：早期蛋白编码区(E)、晚期蛋白编码区(L)和非编码区(NCR)。HPV通过上皮细胞的分化在复制期间合成6种早期蛋白质(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和两种晚期衣壳蛋白(L1和L2)。HPV可以感染宫颈基底上皮细胞，引起病毒增殖，导致上皮增生或瘤变。E5、E6、E7被认为是癌基因蛋白，能持续进行细胞增殖、DNA扩增和DNA损伤修复,由此导致突变、重组和非整倍体的出现。E6能使抑癌基因p53编码的蛋白失活，并通过与E6相关蛋白(E6-AP)相互作用，抑制白介素16(IL-16)的分泌，导致半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)功能紊乱，从而导致免疫监视缺失[7]；E7蛋白与低磷酸化的视网膜母细胞瘤肿瘤抑制蛋白(Rb)结合，破坏Rb与转录因子E2F结合的复合物，导致E2F活性失调，使早期有丝分裂抑制子1(EMI1)累积，从而导致其作用底物细胞周期后期促进复合物(APC/C)异常紊乱，最终使细胞周期紊乱，导致组织增生[8]。E6、E7可以持续高表达于被HPV感染的上皮细胞中，因而成为HPV治疗性疫苗控制或清除感染以及防止癌变的理想靶标。

2 HPV疫苗研究的现状

2.1 预防性疫苗

HPV预防性疫苗通常以主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2为靶抗原，刺激机体免疫应答产生抗体，防止HPV 感染。以 L1 体外表达形成的重组病毒样颗粒(VLP)为靶抗原诱导机体的体液免疫反应，产生中和抗体，在HPV 进入机体前抗体即可与病毒抗原结合，从而防止HPV 的感染。目前，由L1与佐剂形成的重组VLP的HPV亚型疫苗已获得上市许可[9]。2价疫苗(HPV16/18)、4价疫苗(HPV6/11/16/18)或者9价疫苗(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58)疫苗能诱导高效价的中和抗体，对于预防 HPV相关亚型的持续感染及相关的宫颈病变非常有效，但均受到疫苗亚型的限制。生产多价疫苗L1-VLP的复杂性限制了VLP种类的数量以及疫苗保护的广度。另外， L1 肽段的变异性较高，无法产生交叉免疫性，L1-VLP只能有效抑制部分hrHPV，无法预防其他HPV亚型的感染。与L1-VLP相比，较小的衣壳蛋白L2包含共同类型的抗原表位[9]，在动物模型中能诱导低效价但针对HPV亚型范围更广的交叉中和抗体，并提供交叉保护。提高L2肽段的免疫原性,开发广谱HPV L2肽段疫苗是HPV预防性疫苗研究的新思路。

2.2 治疗性疫苗

在HPV慢性感染导致宫颈上皮内损害以及癌变的过程中，通常存在致癌蛋白E6、E7的持续表达。所以目前存在多种针对靶抗原E6、E7的治疗性疫苗，其疫苗类型包括活载体疫苗、蛋白或多肽疫苗以及核酸疫苗等，且不少疫苗的研发工作已进入临床前模型和临床试验阶段。

活载体疫苗通常分为细菌或病毒载体疫苗。这些载体在机体内复制，促进了抗原的传播[10-11]。活载体疫苗有很高的免疫原性,可以产生强烈的细胞和体液免疫反应。他们还可以将E6、E7抗原递呈给抗原递呈细胞(APCs)，促进主要组织相容性复合体( MHC) I和II类分子识别抗原。但是，活载体疫苗有潜在的安全风险，尤其是在免疫力低下的人群中[10]。此外,重复接种相同的活载体疫苗后，产生的免疫反应疗效是有限的[10,12-13]。

多肽和蛋白质疫苗中的多肽和蛋白质组分是从HPV抗原分离出来的，经由树突状细胞(DCs)处理后，被递呈给MHC I 或II类分子，能有效刺激CD8+或CD4+T细胞的免疫应答。多肽和蛋白质疫苗安全稳定,易于生产，显示了巨大的应用前景。

核酸疫苗可以分为DNA疫苗和RNA疫苗。DNA疫苗安全稳定,易于生产，与RNA疫苗或蛋白质疫苗相比，可以使抗原在细胞内持续表达更长时间。另外，DNA疫苗不产生中和抗体,可以重复接种[14]。但是，DNA能编码HPV E6、E7致癌基因，有可能导致细胞转化。RNA复制子可以从几种RNA病毒中分离出来[15-17]，且RNA复制子能自我复制,这可能导致抗原的持续表达和免疫原性的增加。此外,RNA复制子不会形成病毒颗粒，因而不会产生中和抗体，能重复接种。与DNA疫苗相比，RNA没有染色体整合和细胞转化的风险，但RNA疫苗的稳定性很低。

一般来说,治疗性疫苗以多种形式包含E6、E7抗原，并将这些抗原传递给APCs，进一步通过MHC I类和MHC II类刺激抗原表达,从而产生CD8 +细胞毒性T细胞(CTL)或CD4+辅助T细胞(Th)反应。E6、E7抗原在被APCs的MHC I类分子识别之前，先在APCs被蛋白酶加工、消化成更小的肽段。重要的是,并不是所有的这些肽段都能成功加载到MHC分子进而被特异性的T细胞识别[18]。只有一些含有特定抗原表位的肽段能高亲和力地结合到MHC分子，并与能引起免疫反应的特异性T细胞的受体(TCR)发生相互反应[19]。目前，大多数治疗性HPV疫苗致力于诱导E7抗原的免疫反应,因为在临床前模型中，E7抗原免疫反应性比E6抗原更好。

3 HPV治疗性多肽疫苗研究的现状

来源于HPV抗原的多肽疫苗，主要被DCs摄取和MHC I或II类分子提呈，并进一步刺激CD8+或CD4+T细胞免疫反应[20]。目前，多肽疫苗通常致力于诱导高反应性的E6、E7特异性细胞免疫应答，以E6、E7为靶抗原，能引起有利的免疫反应，产生病毒特异的CD4+和CD8+CTL，CTL进一步产生干扰素-γ ( IFN γ)，从而控制和清除被病毒感染的细胞[21]。治疗性多肽疫苗有许多优点，如稳定、安全且容易生产，但其免疫原性很低，不同的HLA个体还需要确定HPV抗原的特定表位[22]。多肽疫苗一般可分为两组: 特定表位短肽疫苗和合成长肽疫苗。

3.1 以E6、E7蛋白为靶抗原的治疗性多肽疫苗

3.1.1 HPV特定表位短肽疫苗众所周知线性短肽抗原表位能够诱导细胞毒性反应，因而使用特定表位短肽疫苗能通过免疫接种特定的抗原表位来确保精准的CTL反应。但这种疫苗局限于患者的HLA类型，因此，在接种疫苗之前通常需要进行HLA的初步分型。

目前，已有一些以HPV16 E6、E7为靶抗原的小鼠或者人的T细胞表位被鉴定，如E7 49-57 、E7 11-20、E7 49-57、E7 86-93 等 CTL表位[23-24]，E7 35-50、E743-77、E750-62、E748-54等Th表位以及兼有CTL表位和Th表位的E643-57[15,23,25]。还有一些特定表位的HPV治疗性短肽疫苗已经进行了临床试验，在VIN或CIN患者中呈现较低的临床反应[26],甚至采用了新的递呈系统[27]。

近期，Kim等[28]鉴定了从HPV16 E7获得的可用于宫颈癌患者免疫治疗的HLA-A* 33;03-限制的新抗原表位。他们合成了14条包含15个氨基酸的多肽，使用流式细胞仪和酶联免疫斑点试验(ELISpot)测量外周血单核细胞(PBMCs)产生的IFN-γ的量以及CD8+CTL的数目，并使用51 Cr与人类宫颈癌细胞系SNU1299细胞释放试验来验证抗原表位的免疫原性。在14条多肽中，E749-63表位刺激PBMCs产生的IFN-γ含量最高，且其致敏的CD8+CTL也显示了更高的细胞毒性效应。在13条包含9～10个氨基酸的多肽中，E749-63、E750-59和E752-61表位诱导产生的IFN-γ含量和细胞毒性效应显著高于其他肽。据此，E750-59和E752-61被认定为HLA-A*33;03限制性的HPV16 E7的新抗原表位，能致敏CD8+CTL,从而对宫颈癌细胞产生抗肿瘤作用。然而，一项研究报告认为，需要谨慎解释肽诱导的CTL作用导致肿瘤细胞溶解的特异性，因为CTL对子宫颈癌细胞系的反应可能是由于同种异体HLA分子的交叉反应而不是E7识别[29]。也有报告认为，这种类型的疫苗治疗可能更适合于侵袭前疾病患者的治疗，如原位癌，因为晚期病变相对较少，病变越小基因越稳定[30]。

由于短肽疫苗的免疫原性较弱，为了增强疫苗效能，通常需要连接脂质和佐剂，如4-1BBL，霍乱毒素突变、CpG寡脱氧核苷酸 (CpG-ODN)、toll样受体( TLR)配体[31-35]。这些方法增强了疫苗激活先天和适应性免疫的能力，促进了CD8+T细胞反应。最近， Lee等[36]发现鞭毛蛋白是一种有效的佐剂，能通过激活TLR5信号，辅助疫苗治疗生殖器癌症。Mardani等[37]用一个简短的两性分子肽载体(Pep-1)与E7肽结合，引起了反应性更强的Th细胞反应，Pep-1肽被认为可用于改进HPV治疗性疫苗。

有研究表明，在纳米结构中的肽抗原能产生比其可溶形式更强的免疫反应。Rad-Malekshahi等[38]利用基于自组装材料的新型纳米材料提高肽抗原的免疫原性。他们开发了两种疫苗递呈系统，通过将一个自组装的肽(Ac-AAVVLLLW-COOH)或一种热敏性的聚合物聚(N-异丙基拉酰胺)添加到不同的肽抗原[卵清蛋白(OVA)250-264、HPV-E743-57]的N端来产生自组装肽抗原(SAPEs)。结果表明，SAPEs能够形成直径20～200nm的纳米结构。在小鼠体内，以CpG为佐剂的SAPEs诱导和增强了CD8+T细胞的抗原性。此外，与安慰剂对照组相比，接种含HPV E743-57肽的SAPEs的荷瘤小鼠，显示了肿瘤生长延缓和生存期延长。然而，也可能出现一些问题，比如由于抗原表位的过早释放而导致T细胞无反应性或者效应低，这些问题对进一步的临床实验的成功提出了挑战。

3.1.2 HPV合成长肽疫苗短肽疫苗可能会出现无法与抗原表位结合的情况，从而无法刺激产生有效的免疫反应；且短肽疫苗是MHC特异性的，只有确定每一个人的HPV抗原的特定表位，疫苗才可能是有效的。因此, 短肽疫苗可能不适合治疗大规模人群，可能的解决方案是应用重叠长肽疫苗改善短肽疫苗。合成长肽疫苗最显著的特点是不需要基于患者的MHC类型选择适宜的疫苗。目前，合成长肽疫苗多在动物实验模型中进行测试[39]，也有一些已经在临床试验中开展测试。动物模型的结果显示被接种动物能产生免疫反应，HPV 16的相关肿瘤也得到根除[40]。Welters等[41]发现HPV16 E6、E7合成长肽疫苗能诱导宫颈癌患者特异性的CD4+和CD8+ T细胞免疫反应。最近，由于合成长肽疫苗具有广泛的免疫原性，且通过免疫原性能引起CD4+Th或CD8+T细胞毒性反应，合成长肽疫苗进一步得到关注。

在一期临床试验中，横跨HPV16 E6、E7肽序列的长肽疫苗在晚期宫颈癌患者接种后显示了低毒性和稳定的免疫原性[42]。35位晚期宫颈癌患者被分为3组，一起接种或者分开接种以Montanide ISA-51为佐剂的HPV16 E6与E7合成长肽疫苗。组1仅在一侧手臂接种300 μg合成肽；组2在一侧手臂上接种100 μgE6肽，并在另一侧手臂上接种300μgE7肽；组3分别接种E6、E7肽，每种肽剂量50μg。在疫苗治疗的4个疗程期间以及结束之后，没有观察到超过2级的毒性反应。酶联免疫斑点实验分析显示, E6、E7肽的整合产生了强大且广谱的T细胞反应。分别在不同位置接种E6、E7肽能增加E7的反应,但对E6产生的免疫反应没有影响。HPV16 E6、E7合成长肽疫苗耐受性良好，甚至在晚期宫颈癌患者也能够诱导广泛的肿瘤坏死因子(INF)相关的T细胞反应。

在一个二期临床试验中，van Poelgeest等[43]对晚期或复发的妇科癌症患者接种HPV16-SLP疫苗的毒性、安全性、免疫原性以及有效性进行探讨。HPV16-SLP由13 条HPV 16 E6、E7重叠长肽组成，并以Montaniade ISA 51为佐剂，20名晚期或者复发的宫颈癌患者接受了疫苗的皮下接种，在整个试验中，没有观察到CTCAE二级以上的系统性毒性反应，仅在一些患者中观察到暂时的类似流感的症状。固相酶联免疫斑点技术(ELISPOT)分析结果显示，13例患者中有11个产生疫苗诱导的免疫反应。试验开始阶段患者对共同记忆抗原的免疫状态反映了患者的免疫状态，对疫苗的反应能力被认为与患者免疫状态呈正相关。但在被评估的12例患者中没有观察到肿瘤的缓解。最后，19名患者因肿瘤恶化死亡。HPV16-SLP疫苗耐受性良好,能诱导产生广泛的T细胞反应，但不能诱导肿瘤缓解，也不能阻止疾病进展。因此,使用这种疫苗应同时配合化疗和免疫调节治疗。

近期，一项研究将HPV16-SLP与优化的toll样受体2配体(TLR2-L)结合,并评估其在体外激活HPV16相关的癌症患者的T细胞的能力[44]。两个高免疫原性的SLP序列均来自HPV16 E6蛋白，与TLR2-L 在GMP条件下共表达。融合蛋白可以使人类DCs在体外成熟，且在体外皮肤模型中皮内注射能激活人类皮肤分离的APCs，并能诱导T细胞趋化因子产生。在患者淋巴结分离的细胞悬液中，TLR2-L SLP能显著增强体外Th细胞活化。结果表明，TLR2-L SLP可以激活循环系统或淋巴结中分离的肿瘤特异性T细胞，可以进一步研究这两个轭合物在I / II期临床试验中的安全性和免疫原性。

3.2 其他HPV蛋白的相关研究

由于E6、E7能诱导机体产生高反应性的特异性的细胞免疫应答，所以，目前的治疗性多肽疫苗多以E6、E7为靶抗原。另外，因为E6、E7是HPV主要的致癌蛋白，用其生产疫苗存在一定的致癌风险，所以需要对E6、E7进行修饰，去除其致癌性，或加强对其CTL表位肽的研究；因而，近年也有一些研究以HPV的其他蛋白如L1、L2、E2为靶抗原，研究其功能和免疫效果。

L1蛋白可以与L2蛋白在体外自行组装形成VLP，目前主要用于预防性疫苗的研制，在预防HPV感染方面取得了巨大成功。近年来，有一些研究表明，L1也能诱导机体产生细胞免疫。因此，L1有可能成为治疗性多肽疫苗的新的切入点。Yokomine等[45]在健康的女性中接种预防性双价HPV16/18 L1 VLP疫苗，发现能增强机体对HPV16 L1来源肽的体液和细胞免疫反应。他们采用多元磁珠悬浮法测定对HPV16 L1来源肽发生反应的免疫球蛋白G(IgG)、IgE、IgA和IgM的水平，用IFN-γ-ELISPOT分析对HPV16 L1来源肽诱导的特异性T细胞反应进行评估。在第1次接种疫苗后的2、7和12个月后，在血浆中，针对位于HPV16 L1 的第293～312 和 300～319位的氨基酸序列(PTPSGSMVTSDAQIFNKPYW)发生反应的IgG、IgM和IgA水平得到显著提高。通过详细的抗原表位定位发现，位于HPV16 L1的第301～310位的氨基酸序列(TSDAQIFNKP)是免疫原性B细胞的一个抗原表位。此外，在免疫接种后，T细胞针对HPV16 L1的第305～313位的HLA-A2和HLA-A24限制的抗原表位(QIFNKPYWL)的反应增加，这表明HPV16/18 L1-VLP疫苗能够同时诱导T和B细胞的特异性免疫反应。由此可见，L1可以诱导机体产生细胞免疫。但该研究的主要目的在于确定HPV16 L1来源的B细胞和T细胞的表位，以监测HPV 16/18 L1 VLP疫苗接种后的免疫反应，并未对鉴定出的T细胞的新抗原表位是否可用于宫颈癌患者免疫治疗进行探讨。

E2蛋白可以调节病毒转录与复制，有B细胞和T细胞表位，当前已有部分E2疫苗进入临床实验阶段，且取得了不错的疗效。ópez-Toledo 等[46]认为免疫接种HPV 16 L1和E2嵌合物，可在小鼠模型中引起细胞免疫反应和抗肿瘤活性。 他们将不同的HPV E2片段融合到L1蛋白中生成嵌合衣壳体，从而生成预防性和治疗性疫苗，并评估它们诱导CTL对HPV 16 E2发生反应的能力，同时保护L1中和表位。在51Cr释放的细胞毒性试验中，c57BL/6免疫小鼠的脾细胞识别并溶解了表达并呈现内生性处理的E2肽的TC-1/E2细胞。而且，这种E2特异的细胞毒性反应抑制了小鼠体内TC-1/E2细胞的肿瘤生长。所以，他们确定了细胞毒性反应中涉及的E2的抗原表位(aa 292-301)。E2也可能诱导机体发生细胞免疫，产生抗肿瘤作用，这也为HPV治疗性多肽疫苗的研究提供了新的思路。

4 HPV治疗性多肽疫苗的不足和展望

活载体疫苗容易使机体产生中和抗体，造成重复免疫效果差的问题； DNA疫苗存在与宿主基因组整合的潜在危险；RNA疫苗稳定性差；E5、E6和E7蛋白疫苗存在致癌风险。相比于其他以病毒、细菌、DNA、RNA等作为载体的合成HPV治疗性疫苗，多肽疫苗治疗效果理想，安全性更高，稳定性也较强，且易于生产，但是其免疫原性较差，通常需要脂质或其他佐剂，比如趋化因子、细胞因子、toll样受体(TLR)配体增强疫苗的效力[47]。这些方法有助于提高疫苗激活先天和适应性免疫的能力,还能进一步提高CD8+T细胞的免疫反应。但是，多肽疫苗是MHC特异性的，这意味着为了产生有效的疫苗，需要确定每一个个体的HPV抗原的特定的免疫原性表位。由于多肽疫苗需要确定机体MHC的特异性，HPV治疗性多肽疫苗面临大规模生产和治疗HPV相关疾病的挑战[48]。目前，可能的解决方案是应用重叠长肽疫苗，这种方法在多个临床前模型中已被证明能有效地诱导抗原特异的T细胞产生免疫应答[49-50]。

HPV治疗性多肽疫苗未来的研究方向应着力于解决HLA型别限制，针对不同人群来筛选安全有效的CTL表位肽，同时需要解决其免疫原性低的问题，筛选合适的佐剂增强其免疫效果。另外，HPV治疗性多肽疫苗的研究不应该只关注E6和E7蛋白，目前HPV其他蛋白的疫苗研究成果也很瞩目，特别是用来研制预防性疫苗的L1和L2，均获得了良好的细胞免疫效果。这说明HPV治疗性多肽疫苗的研究应该向其他蛋白延伸，需要对HPV感染的免疫学机制以及其他蛋白的作用进行更深层次的研究。由于HPV各个蛋白的作用不同，各种疫苗都存在或多或少的不足，研究中可能还需要将多肽疫苗与其他疫苗联合使用以取得更好的疗效。用疫苗进行免疫治疗是一种很有前景的癌症治疗方法，在宫颈病变及宫颈癌患者中,治疗性疫苗的使用与癌变前损害的转归以及临床预后密切相关。与传统治疗相比，治疗性多肽疫苗有巨大优势和可行性[42-43]，具有良好的发展前景。

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