APP下载

除虫菊茎腐病原菌的分离和鉴定

2018-01-27袁丁

农民致富之友 2017年13期
关键词:除虫菊孢菌分生孢子

袁丁

除虫菊茎腐病造成植株由茎基部开始向上变褐、腐烂,后期发展到花叶,整株枯死。本文采用柯赫氏法则,结合菌落、孢子形态等显微特征及ITS序列比对分析,首次证明除虫菊茎腐病主要由禾生镰孢菌直接侵染引起,尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、厚垣镰孢菌亦可从伤口侵入致病。

除虫菊是一种古老的天然杀虫菊科植物。它含有高效杀虫而对人畜无害的活性成分,如其中除虫菊素广泛用于生产杀虫剂和蚊香。随着规模化种植面积扩大和连年种植,病害日益突出,如除虫菊茎腐病危害严重,部分田块几近绝产,已成为除虫菊产业发展的瓶颈。初期,植株茎基部褐色至黑色腐烂,后期,部分侧枝甚至整株茎、叶、花全部黑褐色腐烂枯死。由于种植范围不广,除虫菊病害还未得到广泛关注,许多病原尚不清楚。本文从除虫菊茎腐病发病部位分离和鉴定了病原,旨在为制订该病防治策略提供理论依据。

1材料与方法

1.1病原菌分离

除虫菊茎腐病样本来自云南省峨山县双江镇福泉村。病原菌的分离采用常规组织分离法。从病株上剪下病健交界处,冲洗干净,切取1~2mm×1~2mm的组织,用70%酒精消毒30秒,再用0.1%浓度的升汞溶液消毒1~5分钟,然后用无菌水冲洗3次,每次1~2分钟,最后移植于PDA培养基平板上,置于25℃恒温条件下培养。待长出菌丝后,在菌落边缘用无菌接种针挑取菌丝块移至PDA培养基中,继续放入25℃恒温5d,再置于4℃冰箱内贮存备用。

1.2病原菌纯化

使用稀释法纯化病原菌。将初步纯化的病原菌转移至CLA(康乃馨叶片煎汁培养基)和SNA(Spezieller N?hrstof-farmer Agar)培养基上,25℃、12小时光照黑暗交替培养,期间保持病原菌氧气充足,5-15天后,显微镜下观察其产孢情况。挑取已产孢的菌落,加入1-2mL灭菌水后,用灭菌牛角匙刮取孢子于灭菌水中,吸取孢子悬浮液分级稀释,并各吸取1mL均匀涂在加入氯霉素的PDA培养基上,25℃培养48小時。挑取单菌落菌株培养。

1.3致病菌筛选

除虫菊采用漂浮育苗法培养,发芽后移栽至沙土基质中,按照柯赫氏法则,将纯化后的真菌用牙签接种法插入除虫菊幼苗基部,或菌株培养物土壤接菌的方法接菌,将培养4天,长满菌丝的较薄PDA培养基与灭菌基质混匀,以无菌PDA培养基与基质混匀做对照,覆盖除虫菊种子育苗,待幼苗长出后即可观察发病情况。植株发病后,从植株发病部位重新分离病原菌,最终筛选出致病真菌。

1.4菌株形态鉴定

1.4.1菌落形态观察

挑取纯化后的菌丝,移至直径10cm培养皿的PDA培养基中央,25℃、12小时荧光/12小时黑暗培养96小时后,测量菌落直径,并利用色谱卡观察比较培养基色泽,重复10皿。25℃下继续培养15天,观察是否有菌核产生。

1.4.2分生孢子形态特征观察

将纯化后的菌株转移至CLA或SNA培养基上,25℃、12小时荧光/12小时黑暗培养4-15天后,挑取菌丝,用无菌水制片,观察其产生的分生孢子类型,记录30个大型和小型分生孢子的形态、大小、隔膜数、有无足细胞。为了观察和计算菌丝及孢子,加酸性品红于10%氢氧化铵溶液中制片,盖玻片用两层指甲油涂抹封边。

1.5 rDNA ITS序列扩增与测序

采用何月秋的CTAB法[5]提取镰孢菌株的DNA,以真菌通用引物ITSI (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC 31进行rDNA ITS序列PCR扩增。扩增程序为:94℃预变性10 min;94℃变性1 min;55℃退火1min;72℃延伸2min;共25个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认后送深圳华大基因研究院纯化测序。

1.6菌种的鉴定

将测序得到的DNA序列与NCBI数据库比对的同时,用DNAman、EditSeq等软件对DNA序列比对分析,并用MEGA等分析软件,以Maximum Likelihood法(1000 repeti-tions)构建分子系统树,并结合形态特征,参照Booth形态学分类系统进行种的鉴定。

2结果与分析

2.1除虫菊茎腐病症状

除虫菊茎腐病一般从茎基部、根部开始腐烂,幼苗可见茎基部叶片黑色或褐色腐烂,后期部分侧枝甚至整株茎、叶、花全部黑褐色腐烂枯死,最终导致整株死亡,影响十分严重。

2.2致病镰孢菌的形态鉴定

从供试病株中分离到4种镰孢菌:禾生镰孢菌、莲生尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、厚垣镰孢菌致病,且以禾生镰孢菌为主,它可通过菌培养物土壤接菌法直接致使除虫菊发病,而其他3种镰孢菌可通过伤口侵染。

2.2.1禾生镰孢菌(F.cerealis)的形态(编号D41)在PDA平板上培养96h后,菌落平均直径4.45cm,其边缘稍不规则,菌丝白色絮状,菌落中央呈橘黄色或棕黄色,外缘白色,后期菌落棕色。未见大型分生孢子,小型分生孢子棍棒状,大多有两个隔膜,大小为(7.7-15.3)μm×(2.3-3.5)μm。产孢细胞以芽生的方式产生分生孢子。

2.2.2莲生尖孢镰孢菌(F.oxyspomm f.sp.nelumbicola)(编号D47)在PDA平板上培养96h后,菌落平均直径6.05cm。菌丝白色絮状,由于大量分生孢子生成而呈粉质。小型分生孢子卵形。肾型或椭圆形,通常没有隔膜,极少数有1个隔膜,大小为(5-10)μm×(2-5)μm。大型分生孢子在CLA培养基上大量产生,在SNA培养基上也会生成。大型分生孢子镰刀形,少许弯曲,多数为3隔,大小为(18.8-48.9)μm×(2.4-4.6)μm。

2.2.3禾谷镰孢菌(F.graminearum)(编号D49)在PDA培养基上96h后,菌落平均直径大于9cm。菌丝白色,菌落呈玫瑰红色。实验室培养条件下未见小型分生孢子,大型分生孢子呈镰刀形,有隔膜2-7个,顶端钝圆,基部有明显足细胞。大小为(2.8-6.2)μm×(38.7-64.3)μm。endprint

2.2.4厚垣镰孢菌(F.chlamydospomm)(编号D50)在PDA平板上培养96h后,菌落平均直径5.48cm。菌落边缘整齐,菌丝白色稠密,菌落浅粉红色,中央颜色较深,后期菌落颜色变为棕黄色。未见小型分生孢子,大型分生孢子月牙形短粗壮,有隔膜2-3个,基部无足细胞,大小为(2.8-5.3)μm×(15.8-21.2)1xm。

2.3致病菌株ITS序列的测定与亲缘关系树的构建

分离纯化的菌株ITS序列与NCBI数据库比较的结果:分离的禾生镰孢菌、莲生尖孢镰孢菌同源性为99%,禾谷镰孢菌、厚垣镰孢菌同源性为100%。依据ITS序列与已知菌序列构建亲缘关系树状图可知:D41与禾生镰孢菌亲缘关系较近,为一类镰孢菌,其与其他类型的镰孢菌亲缘关系较远;D47、D49及D50分别于莲生尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、厚垣镰孢菌亲缘关系较近,分属于相应的镰孢菌,其结果与同源比对结果相同。

3讨论

除虫菊在最初引入玉溪市范围内种植时,病害很少。随着种植年限的增加,病害越来越重,其中以茎腐病导致产量损失尤其突出。本研究结合形态学和ITS序列比对分析,鉴定出了4种镰孢菌与该病害有关,其中Fusaritma cerealis以培养物土壤接种,便可引起田间相同的症状,具有很强的侵染能力;Fusarium oxysporum f. sp.nelumbicola,F.graminearum,F.chlamydosporum只是在有伤口时才引起发病,侵染能力较弱。然而,在自然条件下,这后三者是否与前者复合侵染,且是否加重病害,还有待继续研究。

禾生镰孢菌多分离自小麦、大麦的根部和谷粒,也可在蓟等植物上分离到,但其引起的病害报道较少,本文第一次报道其能侵染除虫菊,引起茎腐病。莲生尖孢镰孢菌常被认为存在于水中及沙质土壤中,引起莲藕腐败病,未见到侵染除虫菊的报道,这可能与除虫菊种植范围不广,受关注的程度不够有关。实际上除虫菊亦在沙质土壤上生长较好,它侵染除虫菊引起茎腐病还是有可能的。禾谷镰孢菌能侵染小麦引起赤霉病,侵染玉米引起穗腐病,是禾谷类常见的一类病原菌。厚垣镰孢菌可引起瓜类、茄科、苹果、香蕉、棉、豆科及花卉等植物病害,是常见的土传病原真菌。这两种镰孢菌還未见到其侵染除虫菊的报道。然而,镰孢菌常存在专化型,即同种镰孢菌在不同植物上致病性存在很大差异,这些侵入除虫菊的镰孢菌是否为除虫菊致病专化型,还有待进一步试验证实。

真菌的ITS序列常作为分类的一种辅助手段,但正确分类还要与形态特征等性状相结合。本研究的D47和D49两菌株的形态特征相差很大,前者产生镰刀形大孢子和卵圆形小孢子,菌落白色絮状、粉质,后者仅产生大型分生孢子,菌落呈玫瑰红色,中央有黄色菌丝圈。两者ITS序列分别与F.oxysporum f.sp.nelumbicola和F.graminearum同源性分别为99%和100%,但聚类分析时,D47与D49亲缘关系比较相近,难以区分。本研究依据孢子形态、菌落特征,参考ITS序列信息,D47和D49分别被鉴定为F.oxysporumf.sp.nelumbicola和F.gramineamm。endprint

猜你喜欢

除虫菊孢菌分生孢子
不同基因型生态型除虫菊中的除虫菊酯含量分析
天然植物源农药除虫菊酯的杀虫特性、作用机制及应用
油松枯梢病菌孢子萌发率测定方法探索
镰孢菌与大豆根腐病研究进展
湖北省蔬菜根际土壤中的镰孢菌分布特征
四川省套作玉米茎腐病致病镰孢菌的分离与鉴定
油松枯梢病菌分生孢子器诱导方法探索
不同栽培方式对除虫菊产量及质量的影响
最著名的灭虫植物
尖镰孢菌细胞色素P45055A1与NO相互作用的荧光光谱法研究