孙启星，侯杰，周其洋，童星*

(1.佛山市海天调味食品股份有限公司，广东 佛山 528000；2.佛山市海天(高明)调味食品有限公司，广东 佛山 528500)

酿造调味品含有丰富的蛋白质、氨基酸、糖和维生素等营养物质，容易引起微生物的生长繁殖，使食品发生变质。在食品生产过程中，通常添加食品防腐剂杀菌或抑菌来保持食品品质。目前在调味品行业中，常用的防腐剂主要为化学防腐剂，如苯甲酸钠、山梨酸钾等。随着人们生活水平的日益提高，越来越多的消费者追求绿色食品，并且更加强调天然防腐剂的使用，因而探索天然产物作为食品防腐剂已成为研究热点[1]。天然防腐剂是指从天然生物中提取的具有抑制微生物生长和保护产品的功能性物质，根据其来源不同，分为微生物源防腐剂、植物源防腐剂和动物源防腐剂，其具有化学合成防腐剂无法比拟的优点，如：抗菌性强、安全性高、热稳定性好、作用范围广等[2]。微生物源防腐 剂是指微生物本身或其代谢产物具有抑菌防腐的功效，是一种安全无毒、天然高效的食品防腐剂，可通过微生物培养过程进行工业化生产[3]。本文主要介绍了3种常见的微生物源食品防腐剂的理化性质、抑菌机制、抑菌性以及在调味品中的应用研究，旨在为开发高效、安全的天然防腐剂应用于调味品行业的研究提供参考。

1 乳酸链球菌素

1.1 理化性质

乳酸链球菌素(Nisin)是由34个氨基酸组成组成的多肽抗菌素类物质，分子量为3150 Da，其活性体为二聚体或四聚体[4]。Nisin作为一种白色易流动的粉末，其稳定性和溶解性都与溶液pH值密切相关，在中性和碱性条件下几乎不溶解，食品加工应用时要先用酸性溶液溶解。在pH 6.5条件下，85 ℃加热15 min，活性损失40%，而在pH 2.0盐酸中，121 ℃高温灭菌仍保持活性。Nisin对人体无毒害作用，易被消化水解为氨基酸，并且不改变肠道内正常菌落，是一种安全的防腐剂。

1.2 抑菌机制

Nisin的抑菌机理还没有明确的定论，目前已研究成果表明，Nisin是带正电荷、疏水性的多肽物质，能结合于细胞壁上带负电荷的磷壁酸、酸性多糖或磷脂分子上，抑制细胞壁主要成分合成或与细胞膜形成孔道复合物，消耗ATP，改变细胞膜结构，从而终止细胞的一系列能源反应，使细胞内ATP、离子等流出，导致细胞膜内外能差消失，引起细胞死亡或消融[5]。Breukink E等[6]研究表明Nisin主要依赖于肽聚糖分子作用在细胞膜上，形成空洞，造成内容物的泄露，导致细胞自溶死亡。Zhao Xingchen等[7]通过基因表达方式分析，Nisin是通过阻碍金黄色葡萄球菌中主要功能性基团的转录而起到抑菌作用，对其抑菌机理进行了微观研究。Nisin对芽孢的作用是在芽孢萌发前期破坏膜结构，抑制其发芽而非杀死芽孢。

1.3 抑菌特性

乳酸链球菌素能有效地杀死或抑制食品腐败变质的革兰氏阳性菌，如产芽孢杆菌、耐热腐败菌、葡萄球菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等，根据这一特性它被广泛地应用在经热处理的包装食品中作为防腐剂。Nisin对革兰氏阴性菌、酵母和霉菌没有抑制作用，但是与其他防腐剂复配使用能增强其抑菌作用，扩大抑菌范围。利用Nisin不抑制酵母菌的特性，可被用于啤酒、果酒等酒精饮料中，防止乳酸菌引起的酸败。贺松等[8]证明Nisin对乳品工业常用的乳酸菌具有较强的抑菌作用，抑菌效果持久，可达30～48 h。近年来也有研究表明，在一定条件下，如冷冻、加热、低pH等，Nisin可以抑制一些革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等。Khan等[9]研究表明，在pH 5～6条件下，当一定浓度的Nisin与EDTA结合时，可以抑制大肠杆菌、李斯特氏菌的生长。

1.4 在调味品中的应用

作为一种天然防腐剂，Nisin已经被广泛应用在乳制品、肉制品、罐头食品、啤酒和果汁饮料中，在调味品中的应用研究也有报道。在调味品中应用，Nisin的主要功效为：(1)建立复配型防腐剂，发挥多种防腐剂的互补增效作用，增强抑菌效果，延长食品保质期，如姜元荣等[10]将Nisin和纳他霉素复配应用于酱油防腐，可降低MIC至8 μg/kg，有效抑制酱油的霉变，延长货架期保存时间；(2)降低灭菌温度，缩短热处理时间，降低高温对食品营养和感官的影响，如李增利等[11]研究表明Nisin可代替化学防腐剂用于酱油的防腐保鲜，减轻酱油的巴氏灭菌强度，保持酱油原有营养成分、风味、色泽，延长货架期；(3)酸性热稳定，对食品色、香、味、口感无影响。

除了在成品中添加Nisin抑制微生物生长外，也可在发酵过程中加入，这优于化学防腐剂的特性。如在白酒发酵过程中加入Nisin，可有效降低白酒总酸，抑制白酒发酵中乳酸菌的生长繁殖，控制白酒醪液中乳酸、乳酸乙酯的生成，提高白酒品质[12]；而酱油等调味品由多菌种天然酿造而成，发酵过程中添加Nisin也可抑制特定菌种或杂菌对品质的影响。

在其他调味品应用上，Nisin主要是与其他防腐剂进行复配使用，而非单一添加应用，因此后续在开发Nisin防腐效果上，应采用复配型防腐剂。

2 聚赖氨酸

2.1 理化性质

ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由放线菌通过微生物发酵生产的一种同型氨基酸聚合物，是一种次级代谢产物，其由L-赖氨酸的ε-NH2和α-COOH缩合而成，分子量约为3500 Da[13]。ε-PL多以盐酸盐形式存在，其成品为淡黄色粉末，在水中溶解度较大，但是难溶于有机溶剂。ε-PL水溶液略有苦味，无其他不良口感；热稳定性好，在高温加热条件下，如120 ℃加热处理20 min，均保持抑菌能力。不同聚合度ε-PL具有不同的抑菌活性，目前研究表明当ε-PL聚合度为28～35时，其抑菌活性最好，当聚合度低于10时，则失去抑菌活性[14]。ε-聚赖氨酸是由L-赖氨酸聚合而成，进入人体后，能够很快被人体消化分解为赖氨酸，而赖氨酸是食品中需要强化的氨基酸，同时也是人体必需的8种氨基酸之一，因此聚赖氨酸是一种非常安全的微生物抑菌剂，并且能够提供给人体营养。

2.2 抑菌机制

目前已有研究表明，ε-PL是通过静电吸附作用结合于细胞表面，然后通过一系列的反应使细胞死亡或自溶。ε-PL的作用方式主要是改变细胞膜的结构，进而改变细胞形态，使磷脂双分子层弯曲或形成囊泡等，使细胞膜功能紊乱，阻止胞内外的物质交流和转换或抑制RAN转录等，从而导致细胞自溶或者死亡。Ye等[15]研究表明，当以ε-PL处理E.coliO157∶H7时，ε-PL首先与细胞膜相结合，从而改变细胞膜的流动性和完整性，阻碍细胞膜内基因的转录表达，同时诱导ROS产生氧化压力和SOS反应，使细胞发生自溶。Hyldgaard等[16]研究进一步发现，ε-PL不仅能够与细胞膜相结合，还能够进入细胞内部，直接影响细胞内蛋白质的合成，或影响细胞呼吸作用，改变其代谢功能，从细胞内部诱导细胞凋亡。

2.3 抑菌特性

ε-PL的抑菌谱较广，对绝大部分微生物均具有抑菌作用，其中对革兰氏阳性和阴性菌、细菌、霉菌的抑制效果最强，在100 μg/mL以下就能达到较好的抑菌效果，对其他微生物抑菌作用根据不同体系抑菌强弱不同。Delihas等[17]研究表明，ε-PL对各种细菌都具有抑菌作用，其中分期杆菌抑菌效果最强，其他细菌抑菌效果稍弱，但是都能达到良好的杀菌作用。ε-PL对微生物孢子也具有显著抑制作用，如Hiraki等[18]以B.coagulans,B.stearothermophilus和B.subtilis3种芽孢杆菌作为研究对象，研究结果表明：ε-PL能够有效抑制孢子的萌发，其抑制浓度分别为12.5，2.5，12.5 μg/mL。在碱性条件下，ε-PL抑菌活性大幅下降，这是因为ε-PL等电点在9.0左右，不能通过静电吸附作用在微生物上，进而引起杀菌作用，而在中性和微酸性环境中具有极强抑菌活性。ε-PL热稳定性较好，Hu Y T等[19]发现ε-PL经高温处理后，不仅能够保持抗菌性，还有很强的乳化特性，不受高浓度食盐影响。此外，还具有水溶性好，不影响食品风味等优点。

2.4 在调味品中的应用

我国于2014年批准聚赖氨酸作为食品防腐剂在食品中使用，目前其在调味品中的应用研究较少。由于ε-PL具有广谱抑菌性特点，在调味品中可单独添加应用，如在酱腌菜中，单独添加聚赖氨酸60 μg/mL时，可以完全抑制腐败细菌Bacillussubtilis和Bacillusthurinqiensis生长，抑菌效果优于化学防腐剂(苯甲酸钠和山梨酸钾)；在酱油加工的调味鸡饭的调味液中添加0.12%的ε-PL，浸渍鸡肉后，在30 ℃保存也能大大抑制酵母菌等增值，延长保存期。

为进一步提高抑菌活性，降低使用量，扩大抑菌谱等，ε-PL通常与其他防腐剂复配使用，协同抑菌。程涛等[20]研究表明聚赖氨酸在食醋中的最佳用量为60 mg/kg，并且聚赖氨酸与EDTA、山梨酸钾作为复合防腐剂时，抑菌率达96%以上，能有效延长食醋保质期。

添加ε-PL除了具有防腐作用外，还有利于保持产品色泽。秦芸桦等[21]采用ε-PL对鲜切竹笋进行处理，研究发现经处理过的鲜切竹笋L值和a值均高于对照，有利于保持竹笋色泽。

在其他食品如米饭、面条、汤类和熟蔬菜中，聚赖氨酸被广泛应用，如张春红等[22]研究表明，添加ε-PL湿面条保鲜时间比化学防腐剂延长了20%，并且使用价格低于化学防腐剂；在冷鲜肉保藏上，李迎秋将牛肉经过ε-PL处理后，不仅能够有效抑制微生物的生长，还能保持牛肉的色泽，减少蛋白质的损失，其最佳处理浓度为1.25%。因此，ε-PL被广泛应用于各种食品中，其在调味品中也具有广泛的应用前景和巨大的市场价值。

3 纳他霉素

3.1 理化性质

纳他霉素是一种多烯大环内脂类抗菌剂，外观呈白色或奶油色，为无味结晶粉末，相对分子量为665.75。纳他霉素是一种两性物质，分子中含有酸性、碱性两种基团，等电点为pH 6.5。其微溶于水和有机溶剂中，难溶于大部分非极性有机溶剂，室温下水中的溶解度为30～100 mg/L。在pH 4.5～9之间非常稳定，在极端pH条件下会迅速失活，但是对其抗真菌活性没有明显影响。热稳定性好，121 ℃加热30 min，活性几乎无损失，但是对紫外线敏感，不宜与光接触。一些氧化剂(过氧化氢、漂白粉)和重金属(铁、铅、汞等)也会影响纳他霉素的活性。

3.2 抑菌机制

纳他霉素的抑菌机理主要是通过纳他霉素的疏水性部分与细胞膜表面的甾醇类化合物相结合，主要以范德华力作为引力，形成一种复合物(抗生素-甾醇复合物)。这种复合物的形成能够改变细胞质的通透性，导致细胞内营养物质、ATP、氨基酸、蛋白质等重要物质渗漏，或引起胞内一系列化学反应，进而使细胞死亡。Vimr通过等温滴定比色法和直接结合法的研究显示，纳他霉素可专一性地与细胞膜中的麦角固醇结合，与小囊泡形成显著的相互作用，而不与不含甾醇的小囊泡发生相互作用[23]。另外也有研究表明，纳他霉素特异性地结合甾醇后，并没有改变细胞膜的通透性，而是以一种未知的机制来抑制真菌的生长[24]。纳他霉素的抑菌机制与麦角固醇存在密切关系，因此，那他霉素的抑菌活性主要取决于微生物的细胞壁或细胞上是否存在类似固醇化合物，这是其抗菌的关键基础。

3.3 抑菌特性

纳他霉素对几乎所有的霉菌和酵母菌都具有抗性，但是对细菌和病毒无效。在抑菌效果上，纳他霉素抑菌作用比山梨酸钾强100～200倍，如大部分霉菌在纳他霉素0.5 μg/mL以下时被完全抑制，而酵母菌需要在5 μg/mL浓度才会被抑制。孙启华等[25]通过试管稀释法和琼脂稀释法对纳他霉素的抑菌效果研究表明，纳他霉素对所试黄曲霉菌、青霉菌和酵母菌具有较强的抑制作用。Erich等[26]研究表明，经过人为诱导，真菌对纳他霉素几乎不形成抗性，这主要是由于纳他霉素对真菌具有较强抑菌活性。由于纳他霉素对细菌不起作用，可直接加到酸奶等发酵品中，从而抑制产品中霉菌、酵母菌等有害真菌的繁殖。此外，Ray报道纳他霉素能减少黄曲霉中的黄曲毒素、赭曲霉中的赭曲霉素和青霉菌中的青霉素的产生，减少真菌毒素对人类造成的危害[27]。

3.4 在调味品中的应用

纳他霉素是一种抗真菌制剂，对霉菌和酵母菌具有极强的抑制作用，因此在酱油、食醋等调味品中单独添加纳他霉素，可防止霉菌和酵母菌引起的变质。陆晓滨等[28]研究了纳他霉素在酱油中的应用，当纳他霉素添加量为15 mg/kg时，能够有效抑制酱油中耐盐性酵母菌的生长繁殖，防止白花的出现，且纳他霉素使用成本低，对酱油的品质和风味无影响[29]。同时，在蚝油中添加纳他霉素，可以有效抑制蚝油的霉变，延长保质期达4周以上。姚勇芳等[30]研究表明纳他霉素在酱油中应用效果良好，能有效抑制霉菌生长，提高产品货架期。

调味品应用具有使用频繁、常温储存、易暴露空气等特点，易感染除真菌外的细菌等杂菌，因此实际应用上纳他霉素不能作为单一防腐剂使用，需与其他防腐剂协同作用。丁培峰等[31]研究表明，在酱油中添加任何一种天然防腐剂(纳他霉素、乳酸链球菌素、茶多酚)，只能起到部分抑菌作用，不能达到酱油保鲜效果，将天然防腐剂复配后，利用各自抑菌互补的特性，能够抑制货架期内微生物的增殖。其他研究也表明，纳他霉素和茶多酚复配后使用防腐效果优于山梨酸钾化学防腐剂，并可提高酱油的营养价值和保健功能[32]。

纳他霉素也可在发酵过程中添加，抑制杂菌生长，促进优势菌群生长繁殖。韩德权[33]将纳他霉素应用于酸菜发酵过程中，酵母菌、霉菌等杂菌的生长被抑制，而乳酸菌生长不受影响，使产品香气明显改善，酸菜的感官品质明显提高。

此外，在检测方法上，刘超等[34]通过高效液相色谱-串联质谱方法能够准确、高效地检测出酱油中纳他霉素含量，该方法具有灵敏度高、稳定性好、操作简单等特点。

4 展望

近年来，随着消费者对绿色添加剂的关注，天然防腐剂代替化学防腐剂是调味品行业未来发展的趋势。目前，天然防腐剂在食品行业已经逐渐投入实际应用，本文所述的3种微生物源防腐剂被美国、日本、韩国等国家广泛应用在食品防腐上，除了改善食品的保质期和安全性外，也有利于保持食品品质营养和开发新产品。国内在生物防腐剂上的研究起步较晚，虽然已应用在不同食品上，但是在调味品上的实际应用还未见报道。这主要是由于生物防腐剂的大规模推广应用还存在许多问题，如在实际食品体系中生物防腐剂的抑菌水平、单一防腐剂应用的局限性等。通过加深生物防腐剂的研发和应用，根据不同产品的生产工艺、配方和贮藏环境等不同，开发出不同复合型生物防腐剂，并且精确评估其抑菌作用，保证消费者的健康饮食。

除了本文所陈述的3种常见微生物源食品防腐剂外，越来越多的天然防腐剂被开发应用，如红曲、壳聚糖、抗菌肽等。随着对抗菌物质分子结构、抑菌机理和抑菌性的不断深入研究，高效、安全、廉价的食品防腐剂将被逐渐应用，大大提高行业品质。

综上所述，微生物源食品防腐剂将会得到广泛应用，促进调味品行业产业升级。