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3种虫草水提物体外抗氧化能力研究

2018-01-25罗胜勇栗原博乐志勇于留荣曹晖

绿色科技 2018年14期
关键词:超氧化物歧化酶抗氧化活性

罗胜勇 栗原博 乐志勇 于留荣 曹晖

摘要:测定了天然冬虫夏草、人工培育冬虫夏草及发酵虫草菌粉三种虫草样品水提取物的体外抗氧化能力及其所含SOD活性,分析了3种样品体外抗氧化能力大小是否与其所含SOD活性高低有关。测定结果表明:各样品对DPPH·、超氧阴离子都有很好的清除作用,最大清除率大小依次为:天然冬虫夏草、人工培育冬虫夏草、发酵虫草菌粉;半教清除浓度从小到大依次为:天然冬虫夏草、人工培育冬虫夏草、发酵虫草茵粉。各样品均具有一定的总抗氧化力和总还原力,总抗氧化能力大小依次为:天然冬虫夏草、人工培育冬虫夏草、发酵虫草茵粉;总还原力大小依次为:天然冬虫夏草、发酵虫草菌粉、人工培育冬虫夏草。样品SOD活性高低依次为:天然冬虫夏草、人工培育冬虫夏草、发酵虫草菌粉。3种样品体外抗氧化能力高低与其所含SOD活性高低有密切关系。

关键词:天然冬虫夏草;人工培育冬虫夏草;发酵虫草菌粉;抗氧化活性;超氧化物歧化酶

中图分类号:R282. 71

文献标识码:A

文章编号:1674-9944(2018)14-0245-04

1 引言

氧自由基是一类具有不配对电子的活泼化学基团,与人体健康具有密切关系。生理状况下,人体内氧自由基的产生和清除保持平衡,但当体内清除自由基物质不足、自由基过多时,就会与许多生物大分子发生氧化损伤反应。现代医学研究表明衰老、炎症、癌症、心血管疾病以及帕金森阿尔茨海默氏等神经退行性疾病都与自由基氧化损伤有关。因此,寻找高效、无毒的具有清除自由基作用的天然抗氧化活性的物质,对预防疾病、延缓衰老具有重要的意义。冬虫夏草(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)为麦角菌科真菌寄生在虫草蝙蝠蛾(Hepialus armoricanus)幼虫上的子座及幼虫内菌核的复合体,是一种名贵的滋补性传统中药材,除含有虫草素、虫草酸、虫草多糖外,还含有丰富的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD),具有明显的抗氧化功能。但由丁天然野虫草资源有限,现市场上多采用人工培养虫草和发酵虫草产物进行替代。研究拟对3种虫草水提取物抗氧化能力及其所含SOD酶活性进行测定和比较,为今后更加科学合理的利用3种虫草资源、开发抗氧化的虫草保健品提供理论依据。

2材料与方法

2.1材料和试剂

天然冬虫夏草、人工培育冬虫夏草,由康美(北京)药物研究院有限公司

提供.批号:201607;发酵虫草菌粉,由浙江万丰企业集团制药有限公司提供,批号:201404225。1,1-二苯基-2-:j硝基苯脐(DPPH),MACKLIN公司提供,批号:C10085683;邻二氮菲,MACKLIN公司提供,批号:C10073869;NADH,Solarbio公司提供,批号:No.81180313;NBT,BIOSHARP公司提供;三氯醋酸,天津市致远化学试剂有限公司提供,批号:20160920;吩嗪硫酸甲酯(PMS),aladdin公司提供,批号:A1614069;2,4,6-三吡啶三吖嗪(TPTZ),Solarbio公司提供,批号:No. 5258021;硫酸亚铁(FeSO4),国药集团化学试剂有限公司生产,批号:2016。229;三氯化铁,上海苏懿化学试剂有限公司提供,批号:20160616;双氧水(H2O2),国药集团化学试剂有限公司生产,批号:20161008;Ve(分析纯),上海润捷化学试剂有限公司,批号:20160701;SOD试剂盒,南京建成生物工程研究所生产,批号:20160516。

2.2仪器与设备

AL104电子天平,梅特勒一托利多(上海)有限公司提供:LTV-1750紫外可见分光光度计,日本岛津公司生产;电热水浴锅,上海医疗器械五厂生产:GL -16G- Ⅱ型高速离心机,上海安亭科学仪器厂生产。

2.3样品制备

水提取:各样品取2g细粉,用25 mL水在25℃振荡提取,隔日用3000 r/min离心15 min,收集上清液,残渣再用少量水浸提1次,合并2次提取液,定容至40mL,样品浓度计为50 mg/mL。取1/2样品用于体外抗氧化实验,剩余样品用于测定SOD酶活性。

2.4样品中SOD测定

丙酮纯化:样品经水提取,将离心后上清液倒人烧杯并置冰水浴中沿杯壁加入1倍体积预冷至-15℃的丙酮,再以3000r/min离心15 min,弃去沉淀。上清液加入0.8倍体积预冷至-15℃的丙酮,静置后离心收集沉淀,将沉淀溶于少量蒸馏水中,透析出除去丙酮。即可得到所需的酶溶液。取各样品丙酮纯化液,按照试剂盒说明分别进行SOD酶活力的测定和计算。

2.5 清除DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯脐试验

样品水提取液原液浓度均为50 mg/mL,分别用双蒸水倍比稀释成25 mg/mL,12.5 mg/mL,6.25 mg/mL,3.12 mg/mL,1. 56 mg/mL,0. 78 mg/mL。4℃保存待用。精确吸取1.0 mL不同浓度各样品液予10 mL试管中,再加入4.0 mL 0.004% (w/v)的DPPH自由慕溶液(用无水乙醇配制),使总体积为5.0 mL。用力摇匀后窒温放置30 min后于524 nm處测吸光度值(紫外分光光度计)。每个样品重复测定3次,取平均值。样品液对DPPH的清除率R按公式计算:

R=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

(1)

式(1)中,A0=4 mLDPPH,溶液+1 mL无水乙醇溶液的吸光度值;A1=4 mLDPPH,溶液+1 mL样品液的吸光度值;A2=4 mL,无水乙醇溶液+1 mL样品液的吸光度值。

以清除率R对样品浓度进行回归处理,计算出各样品的半数抑制浓度(IC50)数值。

2.6清除超氧阴离子自由基作用

精确吸取0. 1mL不同浓度的样品溶液,依次加入1.0 mL磷酸盐缓冲液(pH值7.4)、1.0 mL 150 μmol/L的NBT(pH值7.4的磷酸盐缓冲液配制)、1.0 mL468 μmol,/L的NADH(用pH值7.4的磷酸鹽缓冲液配制)、0.1 mL 60μmol/L的PMS(用pH值7.4的磷酸盐缓冲液配制),混匀,室温下(25℃)静置反应5mm,在560 nm下测定吸光度A。每个样品重复测定3次,取平均值。样品液对超氧阴离子的清除率R按公式计算:

R=( AO - A1)/AO×100%

(2)

式(2)中,A0=0.1mL,甲醇溶液+1.0mL磷酸盐缓冲液+1.0mLNBT+1.0mLNADH +0.1 mL PMS的吸光度值;A1=0.1 mL,样品溶液+1.0 mL磷酸盐缓冲液+1. 0mLNBT+1. 0mLNADH+0.1 mLPMS的吸光度值。

以清除率R对样品浓度进行回归处理,计算出各样品的半数抑制浓度(IC50)数值。

2.7 总抗氧化力测定(FRAP)

TPTZ工作液由25 mL醋酸盐缓冲液(300 mmol/L,pH=3.6) ,2.5 mL 10 mmol/L TPTZ(用40 mmol/LHCl配制),2.5 mL FeCl3 (FeCl3·6H20,20 mmol/L)溶液配制而成。分别取不同体积(0. 15、0.20、0.25、0. 30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL)的0.25 mmol/LFeSO4溶液,用蒸馏水补充至2 mL,再加入1 mL TPTZ工作液,混匀后于37℃反应20 min,后丁593 nm处测定吸光度。用X轴表示FeSO4溶液的摩尔质量,Y轴表示吸光度,得标准曲线。取不同浓度提取物溶液2mL,再加入1 mL TPTZ工作液,混匀后于37℃反应20 min,后于593 nm处测定吸光度。每个样品重复测定3次,取平均值。根据吸光度值和标准曲线,计算结果表示为1g提取物中FeSO4( mmol/L)含有量。

2.8总还原力测定

取1 mL不同浓度样液于试管中,依次加入2.5 mL0.2 mol/L pH=6.6磷酸缓冲溶液和2.5mL 1%铁氰化钾( K3 Fe( CN)6)溶液,50℃水浴保温20 min后决速冷却,再加入2.5 mL 10%三氯醋酸溶液,4000 r/min离心10 min,取上清夜2.5 mL。向该上清液中依次加入2.5 mL蒸馏水,0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液振荡摇匀,静置10 min。700 nm下测其吸光度值(OD),吸光度越大,其总还原力越强。

实验组( Ai):1 mL样品+2.5 mL缓冲液+2.5mL铁氰化钾+2.5 mL三氯乙酸+2.5 mL双蒸水+0.5 mL三氯化铁

对照组(Ao):1 mL双蒸水+2.5 mL缓冲液+2.5mL铁氰化钾+2.5 mL三氯乙酸+2.5 mL双蒸水+0.5 mL三氯化铁

空白组(Aj):1 mL样品+2.5 mL缓冲液十双蒸水8 mL(加入量=铁氰化钾十三氯乙酸十双蒸水十三氯化铁的总量)

清除率(%)=[1- (Ai-Aj)/Ao]×100.

2.9数据处理

采用SPSS17.0软件进行数据分析,计量资料以x±S表示,组间比较采用t检验。

3结果

3.1各样品中SOD含量

每个样品取提取原液进行测定(50 mg/mL),重复3次。结果显示,天然虫草中SOD含量最高,人工培育虫草次之,发酵虫草菌粉中SOD含量最低。具体结果见表1。

3.2各样品对DPPH·的清除作用

结果显示,各样品对DPPH·都有很好的清除作用,最大清除率从大到小依次为:灭然虫草、人工培育虫草、虫草菌粉,3种样品对DPPH·最大清除率差异有显著性;DPPH·半数清除浓度从小到大依次为:天然虫草、人工培育虫草、虫草菌粉,3种样品对DPPH·半数清除浓度差异有显著性。具体结果见表2、3。

3.3各样品对超氧阴离子清除作用

结果显示,各样品对超氧阴离子都有很好的清除作用,最大清除率从大到小依次为:天然虫草、人工培育虫草、虫草菌粉,3种样品对超氧阴离子最大清除率差异有显著性;超氧阴离子半数清除浓度从小到大依次为:天然虫草、人工培育虫草、虫草菌粉,3种样品对超氧阴离子半数清除浓度差异有显著性。具体结果见表4、5。

3.4各样品总抗氧化力

3.4.1硫酸亚铁标准曲线

根据浓度梯度测定吸光度值计算标准曲线,具体结果见表6、图1。

3.4.2 各样品吸光度值及总抗氧化能力

根据硫酸亚铁含量标准曲线和各样品吸光度值,计算各样品中硫酸亚铁含量,并以硫酸亚铁含量大小反应各样品总抗氧化能力大小。结果显示,各样品均有一定的总抗氧化能力,总抗氧化能力最强为天然虫草,人工培育虫草和虫草菌粉次之。与天然虫草相比,人工培育虫草和虫草菌粉总抗氧化能力有明显降低,差异有显著性,人工培育虫草与虫草菌粉差异无显著性。具体结果见表7。

4讨论

目前市场中虫草主要分为天然虫草,人工培育虫草和虫草菌粉三类。以往研究表明冬虫夏草中具有明显抗氧化作用,并含有丰富的超氧化物歧化酶( SOD),但关于天然虫草与人工培育虫草及虫草菌粉的抗氧化能力之间的比较研究以及虫草产品的抗氧化能力与其所含的SOD是否有关还缺少报道。由于天然产物中含有成分较多,采用不同的抗氧化活性评价体系,不同溶剂提取物的抗氧化活性存在差异”。因此在进行抗氧化剂筛选时,应该采用多种方法综合评定中药的抗氧化能力才较为准确。研究表明DPPH·自由基清除率与OH清除率、H2O2清除率相关性很低,但DPPH·自由基清除率与总抗氧化能力和总还原能力间呈显著性相关性。而·OH清除率、H2O2清除率与总抗氧化能力和总还原能力相关性也较低。因此本研究采用DPPH·、超氧阴离子自由基清除率、总抗氧化活性、总还原能力测定实验,以便更科学全面地评价受试样品的体外抗氧化能力。结果显示,3种样品均具有明显的体外抗氧化能力,在DPPH·清除、超氧阴离子自由基清除和总抗氧化能力测定试验中,天然虫草的作用均最为明显,人工虫草次之,虫草菌粉作用相对最弱,在总还原力测定中试验中,天然虫草作用仍为最强,虫草菌粉次之,人工虫草作用相对最弱。总体评价,天然虫草的体外抗氧化能力最强,人工虫草次之,虫草菌粉作用相对最弱。

本研究结果还表明,天然虫草和人工虫草中均有明显SOD活性,而天然虫草活性相对更高,虫草菌粉则基本无明显SOD活性,与之相对应的是天然虫草的体外抗氧化能力最强,人上虫草次之,虫草菌粉作用最弱。上述结果表明虫草的体外抗氧化能力大小与其所含SOD活性高低有密切关系,SOD活一降高低可以作为虫草产品的体外抗氧化能力的一个重要评价指标。虽然3种虫草抗氧化能力有差异,但在天然资源有限的情况下,人工培育虫草和虫草菌粉仍然不失为良好的替代品。本次试验结果可为更加科学合理地利用虫草资源提供新的理论依据。

同时研究中也发现,虫草菌粉基本无SOD活性,但也表现出明显的抗氧化作用,表明虫草的抗氧化作用可能还与其他成分有关,比如虫草多糖等。另外应该注意的是,冬虫夏草作为一种滋补药材,主要还是以口服为主,因此后续将进一步对其体内的抗氧化作用进行深入研究。

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