陆文君 综述 李昭铸 审校

哈尔滨医科大学附属第二医院小儿外科（黑龙江省哈尔滨市 150081）

由于全民健身运动的普及，运动、外伤等因素造成的肌腱损伤越来越多，严重影响人们的生活质量并且带来沉重的经济负担。肌腱愈合的潜力有限以及目前外科治疗手段不完善，促使加快发展可替代的治疗方式以促进肌腱组织再生。近些年来提出的组织工程肌腱为肌腱损伤修复提供了可行的途径，即通过联合支架材料、种子细胞、生长因子形成组织工程肌腱以促进肌腱再生[1]。然而生长因子存在价格昂贵、半衰期短、生物活性较低、所需剂量高且难以控制、直接注射可能导致靶器官以外的组织肿瘤发病率升高等缺陷，限制了其在组织工程肌腱中的应用。随着分子生物学技术的发展，通过转基因技术将特定生长因子基因引入合适靶细胞，表达特定的治疗性蛋白，成为肌腱损伤更具前景的治疗方式。近些年来干细胞治疗也被广泛应用于肌腱损伤的修复，包括骨髓间充质干细胞（bone mar⁃row mesenchymal stem cells，BMSC）、滑膜间充质干细胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSC）、肌腱干细胞（tendon derived stem cells，TDSC）等作为干细胞治疗的种子细胞前景广阔。

1 肌腱损伤愈合特点

肌腱损伤后自然愈合的特点通常是纤维瘢痕愈合和扭曲变形的细胞外基质，即排列紊乱的胶原纤维形成粘连导致肌腱功能丧失。自然愈合的肌腱生物化学和机械性能差，容易再损伤甚至断裂[2]。传统的手术治疗方式包括使用自体、同种异体、异种移植，肌腱修复和缝合技术，是目前治疗的“金标准”[3]。然而，在治疗中还有很多尚未解决的问题，自体移植供体或供区有限，异体移植存在免疫排斥反应、术后疼痛、肌腱撕裂复发等。因此，近些年来组织工程肌腱、基因治疗、干细胞治疗等更具潜力的治疗手段不断受到专家学者的重视，相关研究也逐渐深入。

2 基因治疗的原理及可行性

基因治疗是利用病毒、非病毒载体或分子结合载体将外源治疗基因插入目的细胞，通过在靶细胞合成大量具有治疗作用的蛋白质来改善组织修复，或纠正、补偿致病基因造成的缺陷达到治疗疾病的目的[4]。Mao等将血管内皮生长因子基因插入腺病毒载体成功转染64只鸡的全部128个指伸屈肌腱，组织转染效率达到100%，并在转染后2、4、6、8周检测肌腱愈合相关指标，证实转染的基因可在损伤部位维持较长时间表达，并且可以显著提高肌腱愈合强度，不会加重肌腱愈合后的粘连形成[5]。研究认为，外源性基因可在肌腱内维持长时间表达可能是由于肌腱组织免疫活性低[6]。基因转染效率高，无免疫排斥反应，与载体结合后可作用于局部，体内可持续较长时间表达，因此基因治疗是肌腱损伤较为理想的治疗手段。

3 生长因子基因治疗在肌腱愈合中的应用

血小板源性生长因子（platelet derived growth fac⁃tor，PDGF）、转化生长因子（transforming growth factor，TGF-β）、骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等已被证实有促进肌腱组织损伤愈合的作用，并已被应用于基因治疗。生长因子作用时存在时间和剂量依赖性问题。如果将生长因子的基因转染到组织或细胞，维持缓慢持续的表达，则可解决这一问题。BMP具有成骨诱导活性已经成为共识，大量研究发现其对促进肌腱损伤愈合亦起到重要作用。采用BMP-2通过巨细胞病毒载体感染大鼠肾细胞系后与海藻酸钙凝胶混合植入腱骨界面，可显著改善腱骨愈合和促进血管生成[7]。BMP-14基因治疗显著提高大鼠跟腱撕裂损伤模型肌腱的愈合，转染BMP-14的肌腱拉伸强度明显高于对照组[8]。PDGF基因通过二氧化硅纳米粒子（MSN）转染大鼠跟腱，生物力学性能及组织学检查结果均提示其促肌腱愈合能力优于单独使用PDGF治疗[9]。Uggen等使用PDGF基因转染大鼠肌成纤维细胞，以聚合物支架为载体，植入大鼠肩袖损伤模型处，发现损伤部位胶原合成增加炎症反应减轻，并且使撕裂的肌腱组织明显愈合[10]。Wu等将携带TGF-β 1-miRNA的腺病毒直接注射入鸡指屈肌腱损伤模型，发现肌腱周围的粘连形成减少，但肌腱愈合的强度受到不利影响[11]。然而有研究表明TGF-β早期促进肌腱愈合，晚期则是造成过度纤维瘢痕形成的主要原因[12]，肌腱损伤后粘连形成大大影响肌腱的滑行功能，这是手术后的主要临床并发症，TGF-β1在肌腱愈合粘连形成过程中具有关键作用[13]；Cui实验证明肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）能拮抗TGF-β介导的肌成纤维细胞过度增殖分化及细胞外基质的过度沉积，促进肌腱优势愈合[14]。VEGF是一种内皮细胞的有丝分裂原，通过激活一氧化氮合酶增加毛细血管的通透性，促进血管生成，导致血管舒张；因肌腱愈合过程中血管供应不足，故VEGF是损伤后肌腱愈合过程重要的促血管生成因子[15]。Wu等使用腺病毒载体将VEGF基因转染指屈肌肌腱损伤模型，发现可以显著提高指屈肌肌腱的强度，而不会造成肌腱修复后粘连形成增加[16]。FGF或VEGF通过腺相关病毒2型（AAV2）载体基因治疗损伤肌腱产生超正常量的bFGF或VEGF，积极纠正肌腱自然愈合能力的不足；这种治疗方法使bFGF或VEGF明显升高显著改善损伤肌腱中低生长因子活性的缺陷，此外还能显著促进Ⅰ型胶原和其他细胞外分子的产生加速细胞增殖，肌腱强度与对照组相比也显著增加，尤其是VEGF转基因治疗组[17]。

基因转染分为两种方式，一是体内直接转染，即直接作用于肌腱，生长因子基因插入载体后，直接注入体内，在特定部位表达从而产生特定生长因子，但由于在体内基因载体难以与肌腱组织中的细胞结合，导致转染率降低；二是体外间接转染，肌腱中的细胞或干细胞体外培养作为基因治疗载体重新植入肌腱组织，可以提高基因转染率，并可以持续稳定地表达目的基因产生蛋白。

4 干细胞治疗在肌腱愈合中的应用

4.1 骨髓间充质干细胞

间充质干细胞（MSC）最初在骨髓中分离得到，随后发现还可以来源于脂肪组织、脐带血、牙髓、肌肉组织、神经组织、肌腱和滑膜等多种组织；间充质干细胞为非造血基质干细胞，能多向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，不仅容易分离和体外培养扩增，而且几乎无免疫原性，还易于外源基因的转染和表达[18]。外源目的基因通过病毒或非病毒载体整合至MSC基因组中长期稳定表达，移植回体内后可定位于特定组织，通过自我更新可长期存活，并分化为特定的组织细胞。因取材方便、来源广泛，BMSC被广泛用于细胞治疗，基因治疗及组织工程领域，并且BMSC在临床前研究中被证实可促进腱-骨愈合[19]。在兔关节腱骨愈合模型中将BMSC与纤维蛋白胶结合植入大拇趾长肌腱重建术后的骨隧道；4周后，腱-骨界面表现出更垂直的胶原纤维的形成和BMSC治疗组软骨样细胞增殖显著提高，类似于纤维软骨附着，促使肌腱-骨界面愈合良好[20]。此外，间充质干细胞通过旁分泌作用抗细胞凋亡，促血管形成，抗瘢痕形成从而促进肌腱损伤的愈合[21]，还可以通过免疫调节的方式介导巨噬细胞由促炎表型转变为抗炎表型，减轻愈合部位炎症反应[22]。

4.2 滑膜间充质干细胞

De Bari等从尸体及膝关节置换手术术后患者滑膜中消化分离得到SMSC[23]。由于SMSC拥有比MSC更好的增殖分化潜能，被广泛应用于膝关节半月板及肌腱组织修复和再生[24，25]。将1，1'-双十八烷基-3，3，3'，3'-四甲基吲哚羰花菁高氯酸盐（DIL）标记的SMSCs植入腱-骨界面，植入1周后观察DIL标记的阳性细胞明显增加，2周后证实肌腱与骨之间穿通的胶原纤维显著增加；在4周后界面消失，植入肌腱直接附着于骨纤维软骨形成良好的连接[26]。SMSC通过加速纤维结构的形成有效改善早期腱骨愈合。但是滑膜间充质干细胞的使用存在取材来源的问题，限制了其作为种子细胞在肌腱治疗中的应用。

4.3 肌腱干细胞

间充质干细胞还可以从人、鼠、兔、马的肌腱组织中分离得到[27-30]。2007年Bi等人首先在人类和小鼠的肌腱组织中发现肌腱干细胞，经鉴定证明其具备干细胞的特性，因来源于肌腱组织故命名为肌腱干细胞[27]。与其他干细胞一样，肌腱干细胞具有克隆增殖、自我更新和多向分化能力。研究中也表明，肌腱干细胞可以分化为肌腱细胞、非肌腱细胞（包括：脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞）。TDSC是肌腱组织中的分化细胞但仍能在体外生长并维持其细胞表型和产生Ⅰ型胶原蛋白[31]。此外，TDSC还可以保持其在组织中特定的分化特性，使其成为组织工程理想的种子细胞。Ni等使用结缔组织生长因子及维生素C处理过的肌腱干细胞构造组织工程肌腱置入大鼠髌腱开窗损伤模型，并证实有新生肌腱形成及促进肌腱的愈合[32]。然而由于肌腱组织中TDSC含量过低，很难从有限的取材区域中提取出大量的TDSC。研究表明肌腱干细胞为免疫豁免细胞，如果同种异体的组织可以被用来提取肌腱干细胞，那么TDSC可以轻易地从全关节置换手术和前交叉韧带重建手术中残余的肌腱组织分离[33]，这样可解决取材来源问题，确保TDSC在肌腱组织工程的应用。

尽管间充质干细胞组织来源丰富、易于取材、表达干细胞的共同特性，但是干细胞的性能却是不一致的，来源于肌腱组织的肌腱干细胞用于肌腱损伤的修复可能更具优势。细胞治疗时，理想且熟悉的环境能促进移植细胞的增殖、分化。此外，研究表明肌腱干细胞展示出比骨髓间充质干细胞更高的克隆形成性能，表现在肌腱干细胞培养过程中吸收更多原始细胞的能力，TDSC的增殖速度也比BMSC更快，有利于在肌腱组织工程中的应用[34]。

5 干细胞为基础的基因治疗

Wang等证明BMP-12基因转染的间充质干细胞可以被诱导分化成肌腱细胞[35]。BMP-2基因转染骨髓间充质干细胞包裹的腓肠肌肌腱用于兔前交叉韧带（ACL）重建，可积极促进腱骨愈合，软骨样细胞增殖以及纤维软骨形成增加，腱骨间垂直的胶原纤维形成增加，腱骨界面最大负荷能力和刚度也显著提升[36]。Li等将PDGF-β转染BMSCs治疗重建肌腱-骨界面，能有效地增强血管形成和胶原沉积[37]。TGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞利于基因有效传递至损伤部位，使用TGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞治疗受伤跟腱与对照组相比愈合速度更快，最大负荷能力及弹力更强，细胞外基质重建更快，胶原合成增加；其中Ⅰ型胶原与肌腱机械性能的维持密切相关，约占正常肌腱胶原成分总数的95%，而TGF-β1基因转染使Ⅰ型胶原在肌腱愈合中生成速度更快[38]。HGF最初是从血浆和血小板中纯化获得并被认为是一种刺激肝细胞增生的有丝分裂原，能刺激多种类型细胞分化、增殖、再生、运动、迁移及形态的发生，是一种多功能的细胞因子。HGF不仅对肝细胞再生有重要意义，还能促进多种重要器官及组织的损伤修复，如改善肾纤维化、肺纤维化，促进胃粘膜上皮细胞、胆管上皮细胞的再生修复。王俊良等研究表明自体MSCs-HGF移植有利于腱骨界面胶原纤维的重塑和血管的形成[39]。与生长因子的直接应用相比基于干细胞的遗传干预是促进肌腱愈合更具优势的替代方式。这些转染的干细胞可以稳定地分泌相关生长因子。此外，生长因子可以增强干细胞增殖和分化。因此，基于干细胞的基因治疗协同作用可以使生长因子发挥强大、正反馈、持续和稳定的效果。

6 展望

干细胞为基础的基因治疗在促进肌腱组织愈合的应用日益引起重视。这种治疗方式有助于促进肌腱愈合进程。然而，这些结果是在无临床资料的有限条件下得出的。此外，基因治疗应用于临床之前还有很多问题有待解决。其主要局限性在于，转染基因的表达会随着时间的推移而减少，这可能会导致所需目的产物的损失。其次，由于突变、恶性肿瘤的发生发展和其他可能副作用的出现使基因治疗的安全性不能得到保证。在临床应用前，未来的研究需要解决多个问题，包括应用条件、技术和安全问题等。并且细胞治疗刚开始用于临床，缺乏大数据、多中心、随机对照临床试验；在治疗用细胞筛选、大规模扩增、表型稳定等方面，在植入细胞的停泊、生长、转化、与受体组织的融合、功能发挥、神经体液调节等基础研究方面还需要深入研究；在技术层面，对植入细胞的数量、移植时间、移植部位、移植途径等也需要进一步探索[40]。而且干细胞治疗在体内发生作用的分子机制目前尚不明确，干细胞为基础的基因治疗是否能实现损伤肌腱组织的再生，愈合后肌腱的质量及长期效果观察，还需进一步的研究探讨。