徐广洲

【摘 要】以南烛嫩叶为原料，粗制南烛多酚氧化酶（PPO）酶液，采用硫酸铵盐析、透析袋透析的方法，对南烛多酚氧化酶进行初步纯化，并对其酶学性质进行分析。结果表明：南烛多酚氧化酶的最适pH为6.5，最适温度为45℃左右，最适底物为邻苯二酚，本实验为南烛黑色素的制备提供了一定的参考依据。

【关键词】南烛；多酚氧化酶；酶学性质

南烛（Vaccinnium Bracteatum Thunb）属于杜鹃花科越橘属，在江浙、福建、湖广一带，人们以其茎叶浸渍染米加工乌饭。南烛黑色素作为一种植物来源的黑色素，安全性高，受到广泛关注。魏国华等学者提出南烛黑色素的形成可能与酶相关[1-2]，王敬文等人在制备南烛黑色素的过程中，加入一定量的多酚氧化酶或其它类型的酶，得到了颜色更黑的南烛叶黑色素提取液[3]。多酚氧化酶是一种含铜的金属酶，可以用一元酚和二元酚作底物，是发生酶促褐变的主要酶，存在于大多数果蔬细胞组织中。本文对南烛叶中的多酚氧化酶进行分离纯化，并对其酶学性质的进行初步探究，为南烛黑色素的制备提供了一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、曲通拉X-100、硫酸铵、聚乙烯吡咯烷酮、L-多巴、邻苯二酚、L-酪氨酸、绿原酸、愈创木酚、儿茶素、焦性没食子酸。透析袋（分子量：14400）；可见分光光度计；冷冻离心机；磁力搅拌器；pH计；紫外探头型可见光谱仪；电热恒温水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 粗制酶液

取适量新鲜南烛嫩叶，加入磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH6.5），料液比1：5，加入1 %聚乙烯吡咯烷酮以及0.25%的曲通拉X-100，低温匀浆30min，离心（10000rpm，5min，4℃）取清液，即为粗制酶液，4℃保存备用[4]。

1.2.2 酶活性的测定

分光光度计比色法：2.0ml的磷酸盐缓冲液 （0.1M）和0.9ml的邻苯二酚（0.01M）的混合液，0.1ml酶液，恒温5min，混匀，迅速测定反应体系在420nm吸光度变化，以最初直线段的斜率计算酶活力。空白对照：邻苯二酚溶液/磷酸盐缓冲液的混合液。PPO酶活性的定义：每分钟吸光值（420nm）变化0.001定义为1个酶活力单位，及1U，PPO酶活性表示为103×A420/min[4]。

1.2.3 分离纯化

粗酶液中加入硫酸铵，使其饱和度达到20%，4℃下静置4h，然后在10000rpm/min、4℃条件下离心10min，分离沉淀物。将盐析得到的蛋白溶于0.01M磷酸盐缓冲液后，透析除盐，于4℃透析24h，每4h更换透析液[5]。

1.2.4 数据统计与分析

每个实验3个平行2个重复，利用Excel软件统计分析数据，计算标准偏差并制图。

2 结果与分析

2.1 pH对南烛PPO酶活性的影响

以邻苯二酚为底物，研究pH对酶活性的影响，配制不同pH的磷酸盐缓冲液，构建不同pH（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的反应体系，37℃测定酶活，以各pH条件下测得的最高酶活作为100%计算相对酶活，结果如图1所示。pH对南烛叶PPO的酶活性影响非常明显：在pH值3.5-5.5的之间，随着pH值升高，南烛叶PPO酶活性先升高后降低，在pH值为4.5时酶活性较大；pH值继续变大，PPO的酶活力出现相同变化，但酶活性增强，pH值为6.5时酶的活性最高。因此，以邻苯二酚为底物时南烛叶PPO酶的最适pH为6.5。

2.2 温度对多酚氧化酶活性的影响

以邻苯二酚为底物，研究温度对PPO活性的影响。在pH 6.5条件下，在不同温度（5、15、25、35、45、55 ℃）条件下，以各温度条件下测得的最高酶活作为100 %计算相对酶活（图2）。在15℃-45℃之间，PPO活性随温度升高而增加；在45℃-65℃之间，多酚氧化酶活性随温度升高而下降；以邻苯二酚为底物，在pH6.5条件下，45℃左右时南烛叶多酚氧化酶表现出最大酶活性。

2.3 PPO酶的米氏常数

用磷酸盐缓冲液（pH6.5）分别配制浓度为5、10、20、50、100mM的底物溶液，分别测定不同底物在不同浓度条件下的酶活反应初速度，并采用Lineweaver-Burk双倒数法作图，计算底物的Km、Vm值[4]，结果如表1所示。由结果可知，儿茶素对南烛叶多酚氧化酶的Km值最小，有最好的亲和力，但综合考虑Vmax/Km的值大小，南烛叶多酚氧化酶最合适的底物为邻苯二酚。

3 讨论

由于酶的大多数为蛋白质，凡能影响蛋白质的理化因素都可能影响酶的结构与功能，影响酶促反应的因素主要有底物、pH、温度、抑制剂及激活剂等。首先酶在催化反应时，对于底物有严格的选择性，只有酶的活性中心与底物契合的时候，才会发生酶促反应；其次PPO是一种含铜酶，强酸或者强碱条件都可能会导致Cu2+的解离以及蛋白质的变性，从而降低PPO的活性；酶作为催化剂，随着反应温度的升高，分子热运动加剧，单位时间内底物与酶接触的几率上升，酶活性增大，随着反应温度的继续升高，酶蛋白的变性程度不断加深，导致其催化能力的丧失。对比牛蒡、苹果、梨和莲藕 PPO[4，6，7，8]等主要酶学特性发现：邻苯二酚、焦性没食子酸及L-多巴是普遍适合的底物，而酪氨酸，愈创木酚等一元酚不是这些PPO的适合底物；最适pH大多在6.0-7.4范围；最适温度大多在20-40℃范围。

在本实验条件下，南烛多酚氧化酶的最适底物为邻苯二酚，对其酶促反应的最适pH为6.5，最适温度为45℃。这些都为南烛黑色素的制备和南烛叶多酚氧化酶的实际应用提供了一定的参考。本文只是研究了南烛多酚氧化酶部分酶学性质，还可以进一步研究其他底物、抑制剂和激活剂对南烛叶多酚氧化酶的影响。

【参考文献】

[1]魏国华，邵斌，许新德.关于乌饭树黑色素制备的新思路[J].中国食品添加剂，2011，4：135-138.

[2]马养民，王改利，杨秀芳. 植物黑色素的研究进展[J]. 西北农林科技大学学报 （自然科学版），2013，8（41）：189-194.

[3]杜孟浩，王敬文，张金萍.植物型黑色素酶法合成[P].中国CN1651574A，2008-06-25.

[4]Rocha A， Morais A. Characterization of polyphenoloxidase （PPO）extracted fromJonagoredapple[J].Food Control，2001，12（2）：85-90.

[5]冯佳丽，何新叶，笪荣辉，金奎，何志勇，陳洁.南烛叶多酚氧化酶最适提取条件的研究[J].安徽农业科学，2016，44（05）：128-129+132.

[6]李超，郑义，王乃馨，庄平.牛蒡多酚氧化酶的特性及酶促褐变的抑制[J].食品工业技，2011，32（06）：121-124.

[7]邓波.莲藕嫩茎中氧化酶的分离纯化及部分酶学性质研究[D].湖南农业大学，2016.

[8]伍梦瑶，黄莹捷，姚燕妮，黄友谊.勐库大叶种茶树多酚氧化酶粗酶的酶学性质[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2017，43（05）：579-588.endprint