超声微泡携基因治疗肝脏疾病应用进展

2018-01-20席佳达夏国园程祖胜

中国医学影像技术 2018年12期

席佳达，夏国园*，程祖胜

(1.绍兴文理学院医学院，浙江绍兴 312000；2.绍兴市第七人民医院放射科，浙江绍兴 312000)

随着超声微泡造影剂(ultrasound contrast agent, UCA)、超声靶向微泡破坏(ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)技术与超声微泡携基因(ultrasound microbubble carrying gene, UMCG)技术的发展与成熟，超声微泡的治疗作用日渐突显, 通过靶向微泡造影剂(targeted microbubbles contrast agent, TMCA)靶向传输基因、UTMD的空化效应增强基因的转染率，可靶向治疗疾病。UMCG已用于治疗多种疾病。本文主要围绕UMCG治疗肝脏疾病的应用进展进行综述。

1 概述

1.1UCA的发展 UCA的发展历经3个阶段：第1代造影剂内含自由气体，无外膜包被，颗粒较大，稳定性差；第2代造影剂外包白蛋白、脂质、表面活性剂或聚合物等壳膜，稳定性增加，直径也缩小至8 μm以下，可通过静脉注射；第3代造影剂内含氟碳或氟硫类气体，外有壳膜包被，可在血液中持续15 min以上，稳定性大大提高。

1.2TMCA 与普通UCA相比，TMCA表面连接特异性的配体或抗原，经静脉注射后可到达感兴趣区。各类药物或基因通过共价键或静电连接在靶向微泡表面或直接包裹入微泡内，既能有效防止药物或基因被血液中的物质分解，又能将药物或基因运送至目标区域。与传统的病毒、非病毒载体相比，微泡作为基因载体具有安全、定向及有效等特点。

1.3UTMD 通过对目标区域施加一定频率的超声使微泡破裂，定位释放出微泡内的药物或基因，产生空化效应，使血管内皮细胞及靶细胞的细胞膜通透性暂时增加、细胞间隙增宽，在细胞膜及核膜上产生声孔，促进细胞的内吞作用，增加其对大分子物质的吸收，使外源基因更易进入目标组织，具有安全性高及靶向性强的特点。

2 UMCG在肝脏疾病治疗中的应用

2.1肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 我国HCC发病率仅次于肺癌和胃癌，每年死亡人数达32.1万[1]。研究[2]发现UMCG可抑制肝癌细胞转移、生长，或诱导HCC凋亡。1986年Moolten等首次报道通过将单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)转移到肿瘤细胞，可提高核苷类似物(nucleoside analoges, NSA)杀伤肿瘤细胞的敏感度。HSV-TK自杀基因是一种前药酶基因，可通过磷酸化作用使前药丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)转变为细胞毒性药物，达到抗肿瘤作用。Zhou等[3]利用超声靶向破坏包裹HIV-TK基因的质粒，经过48 h转染后，HSV-TK+超声+微泡+GCV组胸腺激酶(thymidine kinase, TK)蛋白表达明显增强，而TK蛋白在目标区域的有效表达是HSV-TK/GCV治疗肿瘤的基础。HIFU可将超声聚焦，瞬间产生高温，使肿瘤细胞发生不可逆的坏死，疗效确切，但存在肿瘤消灭不完全、术后易复发等缺点。谢辉等[4]采用HIFU治疗裸鼠肝移植瘤，消融80%的皮下移植瘤后，再将连接磷脂酰肌醇蛋白多糖3(glypican-3, GPC3)抗体、并携HSV-TK基因的纳米级超分子探针的微泡靶向释放于残瘤中，记录移植瘤中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)及微血管密度(microvessel density, MVD)的变化，发现微泡+HSV-TK+GPC3组的VEGR、HIF-1α mRNA的转录水平明显降低；且肿瘤组织中毛细血管生成受到抑制、MVD水平明显降低，使肿瘤血供受限，从而导致肿瘤缺血坏死。李炯等[5]分析超声微泡联合GPC3抗体及HSV-TK在体外对人肝癌细胞株增殖及侵袭能力的影响，发现超声辐照孵育48 h后载基因靶向微泡组转染率明显增高，而肝癌细胞中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达及侵袭细胞数明显降低，载基因靶向微泡组的细胞凋亡率达49%。

体外合成或基因表达产生的凋亡素可引导多种恶性肿瘤细胞凋亡，但对人体正常二倍体细胞无作用。张园等[6]通过UTMD联合半乳糖聚乙烯亚胺(galactosylated-polyethylenimine, PEL-Gal)介导凋亡素基因，探讨其对小鼠肝癌移植瘤的影响，发现肿瘤组织凋亡率显著增高，Caspase-3蛋白表达显著增加，抑制肿瘤细胞凋亡的Bal-2蛋白表达明显下降。

实验研究[7-8]发现癌胚蛋白GPC3及Hippo信号通路核心效应因子Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)的表达与HCC的产生、发展、凋亡和转移密切相关。潘青云等[9]观察超声辐照携带miR-520c-3p和miR-132微泡转染体外培养的人肝癌细胞，发现miR-520c-3p仅能抑制GPC3mRNA蛋白的翻译过程，引起YAP蛋白及其mRNA表达减少；而miR-132仅能抑制YAP蛋白及其mRNA表达，但对GPC3无影响；以超声辐照携miR-520c-3p及miR-132微泡组，48 h后其细胞增殖率及凋亡率明显低于其余各组，提示其能显著抑制人肝癌细胞株增殖，并促进其凋亡，其机制可能与GPC3与YAP表达的调节有关。

转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)与HCC患者预后不良有关，而被TGF-β活化的长链非编码RNA(lncRNA activated by TGF-β, lncRNA-ATB)是TGF-β信号通路的关键调节物。同时，lncRNA-ATB还能竞争性地与miR-200结合，增加E盒结合锌指蛋白(E-box binding zinc finger protein, ZBE)1和2的表达，从而引起上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和迁移，导致癌症进展和转移。Chen等[10]通过UTMD使lncRNA-ATB沉默RNA(siATB)转染人肝癌细胞株48 h，与对照组相比，siATB+UTMD组ZEB1及ZEB2的RNA及蛋白质均明显受到抑制，同时肝癌细胞的迁移与扩散也明显减少。而与siRNA相比，短发夹RNA(shRNA)更加稳定。JKN信号途径也参与某些疾病和肿瘤的发生发展过程，同时与肝癌淋巴道转移密切相关。张宇虹等[11]通过脂质体转染法与UTMD技术结合，分析JKN1 shRNA对小鼠肝癌细胞株的影响，发现脂质体+超声微泡+超声辐照组的转染率均大于其余各组，提示肝癌细胞株JKN1表达明显受到抑制。CD133是肝癌干细胞(Liver cancer stem cells, LCSCs)的表面标记物，能在EMT过程中发挥作用，同时也是决定HCC发生和总生存期的重要因素。Liu等[12]通过UTMD介导shCD133来分析CD133和EMT在LCSCs中的调节机制，发现通过核转录因子κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)途径抑制LSCSs中的CD133可以逆转EMT，起到抑制肿瘤增殖转移的作用；UTMD体外转染CD133阳性亚群肝癌细胞组内球状细胞明显减少，提示shCD133可抑制肝癌细胞自我更新。

Xue等[13]使用effectene转染剂结合UTMD介导shRNA-Sox9转染人肝癌细胞株，发现effectene+shRNA-SOX9+UTMD组转染率明显高于其余组，Sox9的表达明显减少，提示其能显著抑制肝癌细胞增殖并诱导其凋亡。

2.2肝纤维化(hepatic fibrosis, HF) 肝细胞受到慢性损伤时，肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)是激活HF的中心环节。HF长期持续可转变为肝硬化(liver cirrhosis, LC)，其发病率和死亡率均较高[14]。微泡介导的基因转移可为治疗HF提供新的可能[15]。

2.2.1基质蛋白金属酶(Matrix metalloproteinases, MMPs) MMPs可降解细胞外多数基质成分，有效缓解HF。田力等[16]通过RNAi技术构建定点干扰基质蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)表达的病毒表达载体，并用超声微泡携TIMP-1 siRNA，以UTMD技术转染后，实验组肝组织内TIMP-1、TIMP mRNA含量明显低于模型对照组，MMP含量显著上升，大鼠HF得到一定缓解。

2.2.2肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF) HGF能调节胶原纤维合成与炎性反应，抑制HSC活性，从而阻止HF发展[17]。Jiang等[18]通过超声微泡介导HGF基因转染肝脏，发现超声-微泡-HGF组丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)及谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)含量明显降低，而总蛋白(total protein, TP)含量明显升高，提示大鼠HF受到抑制，肝脏功能得到改善，蛋白质合成增加。夏国园等[19]研究报道，在一定范围内，HGF对肝纤维化的抑制作用随治疗剂量加大而增加。李文艳等[20]制备出质微泡-阳离子脂质体复合物(LMB-CNLP)，使其携HGF基因，并给予超声辐照，探讨其对处于对数生长期的HSC株的影响，结果发现转染24 h后荧光显微镜下可观察到LMB-CNLP组荧光较多，转染144 h后LMB-CNLP组转染率为41.29%，HSC-T6凋亡率达32.81%，可为治疗HF提供基础实验依据。

2.2.3结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF) CTGF被认为是基因干扰HF的潜在靶点[21-22]。杨丹等[23]采用搭载CTGF-miRNA的阳离子脂质体微泡，转染24 h后荧光显微镜下已可见较多绿色荧光；载基因阳离子脂质体-微泡联合超声组的细胞活性与其他组差异无统计学意义，而转染效率明显高于其他组，表明该基因转染方法具有安全性，也为基因干扰治疗HF提供了新思路。

2.3乙型肝炎我国每年约有100万人死于由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)所致肝衰竭、LC和肝癌[24]。抗黏病毒蛋白A(myxovirus resistant A, MxA)对HBV等的抗病毒活性较敏感[25]。刘爱平等[26]以超声辐照在小白鼠肝脏处靶向表达MxA基因，与其余组相比，超声+微泡+质粒转染组肝组织内可见大量MxA表达阳性细胞。Ndc80是细胞分裂的相关基因，Ndc80高表达可促进细胞增殖。Liu等[27]发现Ndc80在HCC组织中的表达增加，而在由HBV引起的HCC中增加更为显著；进一步研究显示，与对照组相比，敲除Ndc80基因的细胞可有效抑制HBV复制，同时也能抑制与HBV相关HCC。