陈兆辉+李媛媛+韩娟+王赟+任彦鹏+陈桐 唐旭+倪良

摘要设计合成了一种基于香豆素衍生物的水溶性荧光探针7二乙氨基3甲醛香豆素，并通过1NMR，13CNMR和MS确认其结构。探针具有良好的荧光发射性能，荧光最大发射峰位于71 nm； 向其中加入e3+后，荧光强度随着e3+浓度的增加而逐渐减弱。探针L的荧光发射强度与e3+的浓度在002～6000 μmol/L范围内呈良好的线性关系，可对e3+进行定性与定量检测，检出限为22 nmol/L （S/N=3），对e3+的选择性良好，不受其它常见金属离子的干扰。此外，探针对e3+的检测具有可逆性。本探针具有很好的水溶性，在生理p环境中检测效果较好成功用于人体淋巴肿瘤细胞Ramos中e3+荧光成像。

关键词荧光探针； 铁离子； 水溶性； 细胞成像

[K][Q（32，X，DY-W][CD15]

20170226收稿； 20171123接受

本文系国家自然科学基金项目（No 2157612）、江苏出入境检验检疫局科技计划项目（No 2016K51）和镇江市重点研发计划——社会发展项目（Nos S201501，S2016019）资助

Email： luckwanting@163com； hanjuan@ujseducn

1引 言

在各种微量元素中，铁元素是人体生理活动中不可或缺的元素，参与DNA和RNA的合成以及维持细胞内渗透压和酸碱平衡等过程[1～]。生物机体内e3+缺失会引发多种生理活动紊乱，导致各种疾病的发生[5]。研究表明，多种疾病，如心脏病、糖尿病甚至某些肿瘤， 与生物体内摄入过量的铁有关[6]。因此，建立高选择性和高灵敏度的铁离子检测方法有重要的理论和实际应用意义。

目前，e3+的检测方法主要有原子吸收分光光度法（AAS）[7]、紫外分光光度法[8]、电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICPAES）[9]、电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）[10]、电化学分析法[11]和荧光滴定法等[12]。荧光滴定法因具有选择性高、灵敏、成本低和易于操作等优点而备受关注[13～15]。但目前用于检测e3+的荧光探针分析方法较少，常见的荧光基团包括卟啉荧光素[16]、罗丹明[17]、香豆素[18]、萘酰亚胺类[19]等，其中香豆素基团凭借其独有的苯并芘喃酮结构，具有荧光量子产率高、斯托克斯位移大等特性，是一种理想的荧光配体。Li等[20]基于香豆素基团合成了用于2O （1∶1， V/V）环境中识别检测e3+的荧光探针，随着e3+的加入，探针的荧光强度逐渐增强。Wang等[21]基于香豆素基团合成了一种荧光探针用于乙醇水（95：5， V/V）体系中e3+的识别检测，荧光强度与e3+浓度（33～167 μmol/L）呈线性相关，检出限为033 μmol/L。该测试液主要为乙醇，探针的水溶性较差，且在进行细胞实验时高浓度的乙醇会对细胞产生毒性，此外灵敏度也较低。En等[22]基于香豆素基团合成了一种荧光探针，用于e3+的识别检测，线性范围为10～1000 μmol/L，检出限为03 μmol/L，该探针的检测灵敏度还有待提高，且在生理p下其荧光效果较差，不利于其在生物方面的应用。

本研究合成了基于香豆素染料的荧光探针L， 此探针具有良好的荧光发射性能， 且e3+的加入会导致探针荧光淬灭。基于此， 此探针可用于e3+的灵敏检测，选择性良好。此探针具有良好的水溶性，用于人淋巴肿瘤细胞Ramos中e3+的检测，结果令人满意。

2实验部分

21仪器和试剂

hermo LXQ液相色谱离子阱质谱联用仪（美国hermo公司）； AVANCE Ⅱ00 Mz核磁共振光谱仪（瑞士Bruker公司）； Cary Eclipse荧光分光光度计（澳大利亚瓦里安有限公司）； UV250紫外可见分光光度计（日本岛津公司）； DM2500倒置荧光显微镜（德国徕卡公司）。

（二乙氨基）水杨醛、丙二酸二乙酯、N，N二甲基甲酰胺（DM）、冰醋酸（美国Aldrich公司）； 人体淋巴肿瘤细胞Ramos由江苏大学食品与生物工程学院提供； 其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）； 实验用水为二次蒸馏水。

22合成方法

探针的合成方法如图1所示。

2217二乙氨基香豆素（1）的合成参照文献[22]方法进行合成。将193 g（10 mmol）（二乙氨基）水杨醛、32 g丙二酸二乙酯（20 mmol）、1 mL哌啶加入30 mL乙醇中，回流搅拌6 h； 减压蒸馏除去乙醇。向混合物中加入20 mL冰醋酸和20 mL浓盐酸，75℃回流搅拌6 h。反应完成后，混合溶液冷却至室温，再加入100 mL冰水。随后逐滴加入0%NaO溶液调节至p 5，产生大量的白色沉淀，用玻璃棒不断搅拌直至不再有新的沉淀生成。抽滤，蒸馏水洗涤后干燥，然后用甲苯重结晶，得到化合物1（17 g，8 mmol），收率为801%。

2227二乙氨基3甲醛香豆素（L）的合成在氮气保护下，向新蒸馏的DM（2 mL）中滴加POCl3（2 mL），在20～50℃下攪拌30 min，得到红色溶液。将化合物1（150 g，691 mmol，溶解在10 mL DM中）逐滴加入到上述溶液中，得到红色悬浮液，60℃下搅拌12 h，然后冷却至室温，加入100 mL冰水中。然后加入20% NaO溶液，获得大量沉淀。粗产物经无水乙醇过滤、水洗、干燥和重结晶，得到化合物L （120 g，89 mmol），收率为708%。1 NMR （00 Mz， CDCl3） δ=1235 （s， 1）， 862 （s， 1）， 7 （d， = 90， 1）， 669 （d， = 22， 1）， 651 （s， 1）， 39 （q， =70， ）， 126 （t， =71， 6） 13C NMR （101 Mz， CDCl3） δ （ppm）： 16555， 166， 1580， 15380， 15023， 13196， 11096， 10853， 1056， 9681， 7738， 7706， 767， 536， 1239。质谱检测ESIMS m/z （[M+]+）： Calcd 262； found： 261。endprint

23紫外吸收及荧光滴定储备液的制备

采用各金属离子的高氯酸配制15种金属离子（Pb2+、Ni2+、Mg2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、e2+、n2+、K+、Li+、Na+、Al3+、e3+、Cr3+） 储备液（10 mmol/L），光谱测量前用二次蒸馏水稀释至10 μmol/L。在本研究所有荧光滴定实验中，激发波长均为00 nm，发射区间为05～600 nm。

2细胞实验

将培养在DMEM（含5%胎牛血清）中的人体淋巴肿瘤细胞Ramos按照15×10个/孔的密度接种到6孔板中， 37℃，5%CO2和95%空气环境中孵育过夜。将探针L（10 μmol/L）加入到细胞孔板中，孵育05 h，移去培养液并用EPES缓冲液洗涤3次，以除去未进入细胞中的探针。随后向各孔中分别加入含e3+（0、 50和100 μmol/L）的DMEM培养液，继续孵育2 h后，移去培养液，用EPES缓冲液洗涤3次。最后加入05 mL培养液，通过莱卡DM2500倒置熒光显微镜进行成像和拍照。

3结果与讨论

31探针检测条件的优化

首先对检测条件进行了优化，考察了不同溶剂（四氢呋喃、水溶液和乙醇）和p值条件下，探针对金属离子的选择性识别能力。荧光光谱显示，用柠檬酸NaOCl 缓冲液调节部分测试液至p 20～65，用EPES调节部分测试液至p 65～90，考察了体系p值对Le3+荧光强度的影响。如图2所示，当体系p=20～90时，加入e3+前后体系荧光强度几乎不变，而未加入e3+的探针L其荧光强度在p=0～50时急剧增加，在p>7时荧光强度开始减小，因此探针检测e3+最适宜的p范围为5～7。

32探针L对e3+的选择识别能力

探针L（10 μmol/L）分别与100 μmol/L 的Pb2+、Ni2+、Mg2+、Cd2+、Co2+、Cu2+、Mn2+、e2+、n2+、K+、Li+、Na+、Al3+、e3+和Cr3+混合后，得到相应的紫外可见吸收光谱图（图3）和荧光光谱图（图）。由图3A可知，在200～350 nm波长范围内，加入e3+后，探针水溶液中吸光度明显增大，而其它金属离子除了Cu2+和Cr3+造成一定程度的红移外，均对探针溶液的吸光度影响不大（图3B）。不同金属离子对探针L的荧光光谱影响如图所示，探针L荧光发射峰位于71 nm处。当加入e3+后，会导致其荧光猝灭（图A），而加入其它金属离子对探针L的荧光强度影响不大（图B）。上述结果说明，探针L对e3+具有良好的选择性。

图e3+（100 μmol/L）（A）及其它金属离子（100 μmol/L）Pb2+、 Ni2+、 Mg2+、 Cd2+、 Co2+、 Cu2+、 Mn2+、 e2+、 n2+、 K+、 Li+、 Na+、 Al3+、 Cr3+的加入（B）对探针L（10 μmol/L）荧光强度的影响

igluorescence spectra of probe L （10 μmol/L） in the presence of e3+ （100 μmol/L） （A） and other metal ions （100 μmol/L） Pb2+， Ni2+， Mg2+， Cd2+， Co2+， Cu2+， Mn2+， e2+， n2+， K+， Li+， Na+， Al3+， Cr3+ （b） in aqueous system

33e3+浓度对探针L的荧光强度影响

图5为加入不同浓度e3+后，探针L的荧光强度的变化。随着e3+浓度增大， 71 nm处荧光强度降低。由图6可知，e3+浓度为002～60 μmol/L时，探针L的荧光发射强度与e3+浓度呈良好的线性关系， I=32256-86Ce3+，R2=09963， 检出限为22 nmol/L（3σblank/k[23]）。将此探针L与其它检测e3+探针比较（表1），本研究合成的探针L具有检出限低，灵敏度高等特点。

探针与e3+结合的ob曲线如图7所示，当探针的含量达到50%时， 27 nm处的荧光强度达到最大，表明探针与e3+的结合比为1∶1。

依据化学计量比为1∶1型主客体配合物，参考文献[2]计算可得探针L与e3+形成的配合物的结合常数K为1276×103 L/mol。由图8可知，1/（0-）与1/[e3+]呈线性关系（R2=0999），进一步证明了探针L与e3+形成1∶1型配合物。由于探针L只有醛基中的氧和酮基中的氧可形成两个化合物配位键，因此，推测其可能的结合方式如图9所示， e3+参与了电子/能量转移过程，使香豆素有机荧光团产生了非辐射能量转移过程，导致荧光猝灭[25]。

35探针与e3+结合的可逆性研究

Le3+与2PO

Symbolm@@ 进行荧光滴定实验。当10 倍浓度（eq） e3+加到探针L中，发生荧光猝灭。随后，将30倍浓度2POSymbolm@@ （300 μmol/L）时体系的荧光强度。

ig10（a） luorescence titration spectra of Le3+ （10 μmol/L） upon the addition of 30 equiv of 2PSymbolm@@ （b） luorescence intensity of L （10 μmol/L） and system upon the alternative addition of e3+ （100 μmol/L） and 2PO

Symbolm@@ （300 μmol/L）

显降低（图10B），表明探针L与e3+是可逆结合，可望重复使用。

36细胞成像实验

将探针L用于Ramos细胞成像实验，结果如图11所示，仅用探针培养的细胞荧光较强（图11B），而继续加入e3+的细胞显示出明显的荧光猝灭（图11C）。此外，用100 μmol/L e3+处理过的细胞显示出比用50 μmol/L e3+处理过的细胞更强的猝灭效应（图11D）。endprint

此外，用細胞计数试剂盒8（CCK8）实验测定不同浓度的探针添加到细胞培养液2 h后的细胞活力。由图12可知，以未经过探针处理的细胞的存活率为100%，当探针浓度达到10 μmol/L时，细胞的存活率在98%以上，表明探针L具有高度的生物相容性。

结 论

本研究合成了一种水溶性良好的香豆素类荧光探针，并将其用于e3+的定性与定量检测。此探针本身发射蓝色荧光，e3+对探针的荧光有猝灭作用，加入e3+后探针的荧光随着e3+的浓度增加而减弱。在e3+浓度为002～60 μmol/L时，探针L的荧光发射强度与e3+的浓度呈良好的线性关系，检出限为22 nmol/L，探针对e3+的选择性良好，且二者的结合具有良好的可逆性。将探针用于人体淋巴肿瘤细胞Ramos中e3+的成像，具有良好的生物相容性。

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AbstractA watersoluble fluorescent probe （7diethyl amino3formaldehyde coumarin） for e3+ detection was designed and synthesized， and its structure was confirmed by 1NMR， 13CNMR and MS spectra his probe showed high emission intensity at 71 nm With the continuous addition of e3+， the emission intensities at 71 nm decreased gradually， and showed an excellent linearity with e3+ in the range of 002-60 μmol/L， and the regression equation was I=32256-86Ce3+ his probe was able to detect e3+ qualitatively and quantitatively with the detection limit as low as 22 nmol/L Besides， this probe showed high sensitivity to e3+ over other metal ions he detection process was reversible， which could be recycled for the e3+ detection In terms of good optical properties and the strong fluorescence in physiological p， the probe was successfully applied in imaging e3+ of living Ramos cells

Keywordsluorescent probe； erric ion； Water solubility； Cell imagingendprint