冯晓斌，李换桃

（晋中职业技术学院，山西 晋中 030600）

芦笋是一种名贵蔬菜，种植面积较大，是我国重要的出口创汇经济作物[1]。我国不是芦笋的原产地，种质资源匮乏，早期引进的常规种或二代种产量低、品质差、病害严重，而且品种混杂，已被国外淘汰。芦笋为雌雄异株，由单基因M控制表达，雄株为Mm，雌株为mm。雄株具有产量高、品质好、抗性强、寿命长等优点，因此，选育全雄品种是芦笋育种的重要目标，进行全雄育种首先要获得超雄株MM，采用常规杂交育种方式一般需要8～10年，而利用小孢子培养获得超雄株仅需要2年左右[2]。小孢子培养芦笋不仅加快了育种进程，而且获得的超雄株高度纯合，是一种高效快捷的方法。文章对芦笋小孢子培养研究现状进行了阐述，并对存在的问题和发展前景进行了分析。

1 芦笋小孢子发育途径

芦笋小孢子发育是雄核发育的一种途径。芦笋雄核发育是指花粉或小孢子沿孢子体途径发育成完整植株的过程[3]，主要包括营养细胞发育、生殖细胞发育、营养细胞和生殖细胞同时发育以及小孢子发育四种途径。通常是由营养细胞或小孢子通过均等的有丝分裂发育成胚状体[4,5]，但在细胞分裂过程中可能会出现异常，从而导致多倍体或嵌合体的出现。其中小孢子发育途径是将未成熟的花粉粒在单核期或双核期时进行诱导培养，改变其原来的发育途径，诱导成胚状体的过程。该发育途径的优点是基因纯合度高，诱导突变体几率较大，能获得大量的不同性状的个体，可以为育种提供丰富的材料。

2 芦笋小孢子培养的影响因素

2.1 供试材料基因型

供体材料的基因型是影响小孢子培养的重要因素[6]。不同基因型小孢子的诱导出胚情况差异较大，包括诱导出胚的难易程度和胚胎的诱导率[7]。赖本智等[8]研究发现，10个不同芦笋品种之间的花药诱导率差异较大。其中UC500W的诱导率最高，诱导率达到53.3%，而UC157的诱导率为22.8%。

2.2 取样时期

小孢子发育需要经过四分体、单核期、双核期阶段，芦笋小孢子培养的取样时期对诱导胚状体非常关键。严准等[9]研究认为单核靠边期是进行小孢子培养的最佳时期。芦笋小孢子发育时期与花蕾、花药的形态特征、颜色及花蕾长度具有一定的相关性。戴勇等[10]研究发现选取花蕾长度为1.5～2.0 mm的芦笋花药小孢子进行诱导，效果较好。

2.3 植株的生长状态

供试植株的生长状态影响着花粉的发育情况，对小孢子培养具有一定的影响。Falavigna等[11]研究认为露地栽培的芦笋雄核发育最好，长日照温度平均为白天25℃，夜间15℃培育的植株小孢子单核期诱导效果较好。

2.4 培养基及添加成分

基本培养基的类型和组成对芦笋小孢子培养具有较大的影响。小孢子培养常用的培养基有MS、Miller、N6、B5、NLN等，不同作物适合不同的培养基。严仁玲等[12]在对石刁柏花药离体培养及单倍体植株再生的研究中得出，芦笋花药培养MS培养基比N6培养基效果好。

外源激素也会对芦笋的小孢子培养产生影响。陈海媛等[13]研究认为，诱导芦笋花药培养的最佳组合为2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，诱导的愈伤组织效果较好，且可直接分化成芽。蔗糖是小孢子培养中常用的碳源，不仅提供能量，还能维持一定的渗透压，有利于小孢子的胚胎发生。周维燕等[14]研究认为蔗糖的适宜浓度为5%～8%，过高的浓度处理抑制花粉诱导。在小孢子培养基中添加活性炭、谷氨酰胺、硝酸银等外源物质可以吸附有害物质，减轻褐化程度，提高诱导效果。

2.5 预处理

芦笋小孢子培养研究中，对花药进行一定的预处理能够提高胚状体发生率。低温刺激小孢子有利于启动雄核发育，温度以4℃左右处理为宜。Peng等[15]研究得出，对芦笋品种G459花蕾进行4℃黑暗处理7～9 d，诱导小孢子出胚的效果较好。此外，他还提出在芦笋小孢子培养前期进行热激处理对小孢子诱导出胚效果较好。Touraev等[16]研究也认为热激处理能启动小孢子发育成孢子体。

3 芦笋小孢子培养后染色体的鉴定和加倍

3.1 染色体的倍性鉴定

倍性鉴定包括直接鉴定法和间接鉴定法。直接鉴定法主要是对植株分生快的部位进行镜检，观察确定染色体数目，如根尖、渐尖、幼叶等。杜胜利等[17]在对黄瓜倍性鉴定的研究中发现，用体细胞染色体计数法可直接、准确的进行倍性鉴定。间接鉴定法的准确度不如直接鉴定法，但却简便易操作。常用的方法包括流式细胞仪鉴定法、叶片气孔大小及保卫细胞叶绿体数目鉴定法、植株形态观察法等[18]。

3.2 染色体加倍

单倍体的染色体加倍方法有两种，一种是自然加倍，一种是人工加倍。自然加倍率较低，现多采用人工加倍。秋水仙素是染色体加倍的常用化学诱变剂[19]。张天翔等[20]研究得出，用0.3%秋水仙素处理芦笋单倍体7 d，染色体加倍效果最好，加倍率可达82.50%。

4 问题与展望

我国对芦笋花药培养的研究较多，花药培养技术也有了较大的提高，但是小孢子培养效果却不理想，在对芦笋的全雄育种中应用的较少，发展进度缓慢。小孢子培养过程中还存在胚状体发生率低、二倍体率低、成苗率低，而嵌合体多、褐化率和玻璃化率高等问题。因此，如何改进小孢子培养技术是下一步研究的重点，高出胚率、高成苗率及高二倍体率将是芦笋小孢子培养的主攻方向。芦笋小孢子培养可以将控制雄性基因M快速分离出来，经加倍获得高度纯合的超雄株。同时小孢子培养在芦笋的抗性育种中具有较大的应用前景，对抗逆性和抗病虫害的研究提供了较好的途径，加快了芦笋的抗性育种发展，且与分子标记技术和基因工程技术结合将不断推进芦笋育种进程。