徐志利，赵雄伟，孙剑锋，*，刘茜，孟淑静

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定071000；2.河北农业大学科技兴农中心，河北保定071000）

海参，既是宴席上的佳肴，也是滋补人体的珍品，其保健价值由古至今一直为人们所称道[1]。医药价值也较高。医学认为，海参“甘、咸，温，补肾益精，壮阳疗痿”；《随息居饮食谱》中说：海参能“滋阴补血，健阳润燥，调经，养胎，利产”。可见，海参有滋补肝肾、强精壮阳的作用，海参具有长期作为民族用药的历史[2]。现已证明，海参体壁中含有海参多糖、海参皂苷及海参胶原蛋白等多种活性物质[3]。此外，因海参似海带、海藻等海产品，含有一定量的碘，故还有促使新陈代谢旺盛、血液流畅的作用。海参号称“精氨酸大富翁”。含有8种人体自身不能合成的必需氨基酸，其中精氨酸、赖氨酸提取率最为丰富。同时海参含有丰富的微量元素，尤其是钙、钒、钠、硒、镁提取率较高。海参具有抗凝血[4-7]、降血栓[4]、抗肿瘤[8-14]、免疫调节、抗菌、抗病毒、促生长、抗衰老等多种药理作用[15]。海参脑苷脂及长链碱是存在于海参体壁中结构独特的鞘脂类化合物[16]。脑苷脂有多种不可替代的功能，在人体内发挥着重要的作用。现在可以明确的知道脑苷脂有一定的抗癌和免疫调节的功能，抗HIV-1病毒的作用，抗肝毒活性的作用，因为其有诸多的重要作用，所以对脑苷脂活性以及提取的方法研究日益更新和精进。超临界技术是一项无毒、无害，使被提取物可以循环利用，超临界流体萃取工艺在密闭低温的操作环境下进行，避免了有效成分与空气接触及遇高温分解氧化等弊端，安全稳定[17]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜海参：市售。

半乳糖脑苷脂：美国Sigma公司；甲醇、正己烷、异丙醇、二氯甲烷均为色谱纯试剂：美国Sigma公司；试验用水均为超纯水；CO2（纯度＞99.9%）：锦德气体有限公司。

1.2 仪器与设备

超临界萃取设备：Thar科技公司；高效液相色谱仪、2424蒸发光检测器：美国Waters公司；LG-0.2型真空冷冻干燥机：沈阳航天新星机电有限责任公司；JP-150A-8高速多功能粉碎机：永康市九品工贸有限公司；CP214电子天平：奥豪斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配置

半乳糖脑苷脂标品的配置：准确称取半乳糖脑苷脂标品，加入甲醇溶解，配置成浓度分别是0.025、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL的溶液。利用高效液相色谱-蒸发光散射检测器进行测定，得到半乳糖脑苷脂标准品的回归方程、线性范围以及相关系数。

1.3.2 样品的制备

将新鲜的海参清理干净，放入热水中煮，煮至海参刚刚发硬，不易形变即可。将海参切成小片，放入冷冻干燥室冻干。将彻底冻干后的海参打碎成粉，过筛，准确称取干海参粉6 g分别在不同的条件下放入CO2超临界流体装置中进行超临界萃取。

优化超临界萃取条件以提高脑苷脂提取率，本试验采取动态萃取并且采用单因素和正交的手段，分别优化萃取压力、萃取时间、萃取温度以及海参粉粒度对海参中脑苷脂提取率的影响，从而选出适宜的工艺条件。

脑苷脂提取率采用下式计算：

1.3.3 影响海参中脑苷脂萃取量的单因素试验

1.3.3.1 萃取压力对脑苷脂提取率的影响

选取温度33℃，动态萃取时间3 h，粒度为60目，依次使压力为 15、20、25、30、35、40 MPa 进行萃取试验，收集萃取物，将收集到的萃取物用甲醇溶解，稀释250倍后过0.22 μm的有机系膜，通过正相高效色谱法-蒸发光散射检测法检测其脑苷脂萃取质量，比较选出适宜的萃取压力。

1.3.3.2 萃取温度对脑苷脂提取率的影响

选取压力为20 MPa，动态萃取时间是3 h，粒度为60 目，选取温度 30、33、36、39、42 ℃进行超临界萃取试验，收集萃取物，将收集到的萃取物用甲醇溶解，稀释250倍后过0.22 μm的有机系膜，通过正相高效色谱法-蒸发光散射检测法检测其脑苷脂萃取质量，比较选出适宜的萃取温度。

1.3.3.3 海参粉粒度对脑苷脂提取率的影响

选取温度是33℃，压力为20 MPa，动态萃取时间是 3 h，分别选取粒度为 20、40、60、80、100 目的海参粉进行超临界萃取，将收集到的萃取物用甲醇溶解，稀释250倍后过0.22 μm的有机系膜，通过正相高效色谱法-蒸发光散射检测法检测其脑苷脂萃取质量，比较海参粉粒度对脑苷脂提取率的影响。

1.3.3.4 萃取时间对脑苷脂提取率的影响

选取温度是33℃，压力为20 MPa，海参粉粒度为60 目，分别选取时间是 2.5、3、3.5、4、4.5 h，收集萃取物，将收集到的萃取物用甲醇溶解，稀释250倍后过0.22 μm的有机系膜，通过正相高效色谱法-蒸发光散射检测法检测其脑苷脂萃取质量，比较萃取时间对海参中脑苷脂提取率的影响。

1.3.4 影响海参中脑苷脂提取率的正交试验

正交试验优化海参中脑苷脂提取工艺条件，在单因素试验基础上，选择萃取压力，萃取温度，海参粉粒度为研究对象，按照L9（33）[18]正交表进行试验，对海参中的脑苷脂的萃取条件进行优化。

1.3.5 色谱条件

色谱柱为 XB-CN 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温为35℃，流动相A为正己烷-异丙醇（99∶1，体积比），流动相B 为二氯甲烷-甲醇（60∶40，体积比），梯度洗脱程序见表1，进样量为20 μL，流速1.0 mL/min，蒸发光散射检测器的漂移管温度为50℃，雾化器为空气，流速2.4 L/min。

表1 梯度洗脱程序表Table 1 Gradient elution program

2 结果与分析

2.1 线性关系及检出限

将半乳糖脑苷脂标准品按照1.3.1的方法配置，按照1.3.3中的条件进行测定，得到的半乳糖脑苷脂标准品的回归方程、线性范围以及相关系数见表2，色谱图见图1。

表2 标准品的回归方程、线性范围、相关系数Table 2 Regression equation，linear range，correlation coefficient of the regression of the standard

图1 脑苷脂标准品色谱图Fig.1 Cerebroside standard chromatogram

由图1可知脑苷脂标准品的保留时间是9.2 min。

2.2 单因素试验分析

2.2.1 萃取压力对脑苷脂提取率的影响

按照1.3.3.1的操作步骤得萃取压力对脑苷脂提取率的影响，结果见图2。

图2 萃取压力对脑苷脂提取率的影响Fig.2 The impact of extraction pressure on cerebroside extraction yield

由图2可知：海参脑苷脂的提取率在20 MPa时达到最大值。因为提高压力会使CO2的密度相应的提高所以会使海参的脂类在CO2中的溶解度增加，并且还减少了传质距离，从而增加了传质效率[19]，因此，提高萃取压力有利于海参脂类物质的萃取。但是压力过高不仅会使设备和操作的费用增加，而且还会对海参脂类的纯度造成一定的影响，故压力不宜过高，所以得出适宜的萃取压力是20 MPa。

2.2.2 萃取温度对脑苷脂提取率的影响

按照1.3.3.2的操作步骤得萃取温度对脑苷脂提取率的影响，结果见图3。

由图3可知在萃取温度达到33℃时海参脑苷脂的提取率也达到最大，之后都是随着温度的升高，脂类的萃取率以及脑苷脂提取率均呈下降的趋势。当超临界萃取的压力不变时，升高温度，有利于海参脂类物质的挥发以及超临界萃取的进行。但是当温度升高，二氧化碳的密度就会降低从而其溶解脂类物质的能力也会降低。如果CO2的溶解能力下降程度对脂类物质的萃取率的影响超过升温增加脂类物质挥发能力对其萃取率的影响时，萃取率就会下降[20]。不过温度过高会使油遭到氧化和造成一些挥发性成分的散失，造成油质量的下降并且对萃取设备也有一定的损耗，所以选择最适宜的温度是33℃。

图3 萃取温度对脑苷脂提取率的影响Fig.3 The impact of extraction temperature on cerebroside extraction yield

2.2.3 海参粉粒度对脑苷脂提取率的影响

按照1.3.3.3的操作步骤得海参粉粒度对脑苷脂提取率的影响，结果见图4。

图4 萃取粒度对脑苷脂提取率的影响Fig.4 The impact of extraction size on the cerebroside extraction yield

由图4可知：海参中脑苷脂的提取率在60目的时候达到最大值其次是80目，其他粒度大小萃取得到的脑苷脂提取率都比较少。海参粉的粒度对海参中脑苷脂提取率有两方面的影响：一方面通过对物料的粉碎，物料粒度减小，增加了颗粒的比表面积从而使海参粉和二氧化碳萃取剂的接触面积增大，减小了传质阻力，有利于提高海参中脑苷脂的萃取提取率；另一方面由于萃取釜压力较高，粒度特别小的物料就会在萃取釜中被压实，极大的增加了物料的堆积密度，从而导致海参脂类的液滴穿不过物料层而进入二氧化碳萃取剂主体，致使脂类的萃取率降低[21]。过细的物料在高压下还可导致萃取釜中烧结板及管路的堵塞，将不利于萃取的进行，所以选取的适宜的海参粉粒度是60目。

2.2.4 萃取时间对脑苷脂提取率的影响

按照1.3.3.4的操作步骤得萃取时间对脑苷脂提取率的影响，结果见图5。

图5 萃取时间对脑苷脂提取率的影响Fig.5 The impact of the extraction time on the cerebroside extraction yield

由图5可知，海参中脑苷脂的提取率在持续增加直到3 h，之后随着时间的延长海参中的脑苷脂开始下降。在超临界流体萃取的初始阶段，超临界流体中溶质几乎为饱和状态，萃取速率最快，随萃取时间的增长，流体中溶质浓度逐渐降低，但溶质的提取率累积增大。增加萃取时间在提高提取率的同时也会提高生产成本，应以经济效益为指标合理选择萃取所用时间，所以选取3 h为适宜的萃取时间。

2.3 正交试验结果

表3 正交试验因素水平表Table 3 Orthogonal factor level table

表4 正交试验结果及分析Table 4 Results of orthogonal test and analysis

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance table

由方差分析表5可以看出，萃取压力、萃取温度、以及海参粉的粒度对萃取海参中的脑苷脂具有显著性影响（P＜0.05）。结合极差分析，可以得出适宜的萃取条件为萃取压力20 MPa，萃取温度38℃，海参粒度60目，此时的脑苷脂提取率能达到0.107 9%，适宜的试验组合为A2B3C1。由以上3个因素的方差分析和极差分析可以得出影响海参油脂萃取率的主次试验因素是压力＞温度＞粒度。

3 结论

该研究先采用单因素试验方法，分别考察了萃取压力、萃取温度、原料粒度、萃取时间4个因素对超临界二氧化碳萃取海参中脑苷脂的影响，筛选了上述4个因素中对海参中脑苷脂的提取率影响较显著的3个因素，继续用三因素三水平正交试验设计进行工艺优化。

试验结果表明，采用CO2超临界萃取技术提取脑苷脂的适宜的条件如下：萃取压力为20 MPa，萃取温度38℃，萃取粒度60目。以此工艺条件萃取的脑苷脂提取率可以达到0.107 9%，本文采用超临界萃取的方法对海参中的脂类物质进行提取，与传统的化学方法比，超临界流体萃取工艺在密闭低温的操作环境下进行，避免了有效成分与空气接触及遇高温分解氧化等弊端，更加清洁[22]，无化学残留，杂质少，速率快，易操作[23]。本文优化了超临界萃取的条件，采用HPLC的方法测定了脂类中脑苷脂的提取率，为以后的研究奠定了基础。

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