迟原龙，唐垚，金璐，张凤，姚开，何强

（1.四川大学轻纺与食品学院，四川成都610065；2.成都市食品药品检验研究院，四川成都610041）

四川泡菜是我国西南地区主要发酵蔬菜制品之一，常被作为烹饪原料、佐餐菜或调味料使用[1]。四川泡菜独特的风味和品质与其中微生物作用密切相关，因此鉴定分析泡菜环境中的微生物对泡菜工艺优化和防腐保质具有重要意义[2-5]。菌种鉴定首先需要提取其DNA物质，目前基于酶法破壁的试剂盒法是提取菌种DNA的常用方法，但其存在成本高、纯化步骤多、耗时长的不足[6-7]。鉴于本文拟采用碱裂解法提取DNA对四川泡菜中分离得到的细菌和酵母菌进行鉴定，以期建立一种经济、快速、准确的菌株鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与仪器

12株待测菌株分离自四川泡菜，其中包括8株细菌（菌株B1～B8）和4株酵母菌（菌株F1～F4），-20℃下保藏。

MRS培养基、PDA培养基：北京陆桥技术股份有限公司；细菌DNA提取试剂盒、真菌DNA提取试剂盒、2×PCR Mix：上海生工生物技术有限公司；PCR引物：成都擎科梓熙生物技术有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

DNA提取缓冲液：将0.584 g EDTA和0.1 g吐温20溶解于1 L蒸馏水中，调节pH值至8.0。DNA提取碱裂解液：将80 g NaOH溶解于1 L蒸馏水中，并利用聚醇类非离子表面活性剂调节pH值至13.4。

Power Pac Basic型电泳仪、PCR仪：美国Bio-Rad公司；Gel 310型凝胶成像系统：美国UVP公司；5427R型高速离心机：德国Eppendorf公司；P330型核酸蛋白仪：德国Implen公司。

1.2 基于碱裂解法提取菌株DNA

将8株细菌和4株酵母菌分别于营养琼脂平板和麦芽汁琼脂平板上活化，然后分别取菌龄18 h菌体10 mg于装有200 μL DNA提取缓冲液的离心管中。以10 000 r/min离心1 min，除去上层液，加入100 μL DNA提取碱裂解液涡旋混匀，90℃水浴15 min，再以10 000 r/min离心1 min，收集上清液即为菌株DNA的提取物。采用核酸蛋白仪测试菌株DNA提取物的浓度，以及其于λ=260 nm和λ=280 nm处的吸收波长A260和A280，以A260/A280表征菌株DNA提取物的纯度[8]。

1.3 PCR扩增、电泳和测序

细菌的16S rDNA PCR扩增采用正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3'）和反向引物1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。反应程序和反应体系参照Haruta等方法进行[9]。酵母菌的26S rDNA PCR扩增采用正向引物NL1（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和反向引物 NL4（5'-GGTCC GTGTTTCAAGACGG-3'）。反应程序和反应体系参照Tofalo等方法进行[10]。

取5 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶以120 V电泳15 min～20 min，通过比对其凝胶成像评价菌株DNA的提取效果。然后将PCR产物阳性克隆送至上海生工生物技术有限公司进行测序。采用Sequence Scanner软件分析测得序列的长度及可信度。采用Dnaman软件拼接双向测序结果并与NCBI-BLAST数据库（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行序列同源性比对，鉴定菌株的种属[11-12]。以试剂盒法鉴定12株待测菌株的结果作为对照，评价碱裂解法菌株鉴定结果的准确性。

1.4 菌株DNA提取方法的成本和耗时分析

对采用碱裂解法和离心柱式试剂盒法提取菌株DNA的成本和耗时进行分析。测试成本是计算完成100次菌株DNA提取所购买的试剂和材料的费用。测试耗时包括准备阶段和提取阶段。其中，准备阶段包括试剂的配制和菌株前处理过程；提取阶段包括破壁、纯化和收集过程[13]。

2 结果与分析

2.1 菌株DNA的提取质量及其PCR扩增产物分析

菌株DNA的提取质量直接关系到PCR扩增的顺利进行，进而影响鉴定结果的准确性。DNA提取浓度和纯度是评价其提取质量的两个重要指标[14]。DNA提取浓度低将导致DNA无法被有效扩增，这可能是由于待测菌株量少、破壁或裂解不充分、沉淀不完全或洗涤时DNA丢失等造成。DNA提取物不纯，表明其中可能含有蛋白、多糖、多酚或金属离子等杂质，将抑制后续酶解和PCR反应。采用碱裂解法对12株菌株DNA的提取浓度和纯度见表1。

表1 采用碱裂解法提取菌株DNA的浓度和纯度Table 1 Concentration and purity of strain DNA extracted by an alkaline lysis method

可以看出，所有测试菌株的DNA提取浓度均处于较高水平（＞40 ng/μL），且其DNA提取纯度均较高（纯DNA物质的A260/A280为1.8～2.0）[15]，这将为后续进行PCR扩增提供保障。

采用碱裂解法提取菌株DNA的PCR扩增产物的凝胶电泳图见图1。可以看出，8株细菌均在1 500 bp附近出现明显条带（图1A），且4株酵母菌均在500 bp附近出现明显条带（图1B），表明采用碱裂解法提取的细菌DNA能够成功扩增出16S rDNA，酵母菌DNA能够扩增出26S rDNA，满足下一步测序的需要。

图1 采用碱裂解法提取8株细菌DNA的PCR产物（A）和4株酵母菌DNA的PCR产物（B）的凝胶电泳图Fig.1 Gel electrophoresis images of 8 strains of bacterial DNA PCR products（A）and 4 strains of yeast DNA PCR products（B）

2.2 菌株核苷酸测序峰图分析

对提取得到的微生物DNA进行PCR扩增，再分析该扩增产物的核苷酸序列，进而判断DNA提取方法的优劣程度[16-17]。细菌B116S rDNA和酵母菌F2 26S rDNA的测序峰图如图2所示。可以看出，细菌16S rDNA和酵母菌26S rDNA中单向DNA链有效序列长度分别达到800 bp和500 bp，且测序信号清晰，规律性好，无杂峰干扰，因此采用碱裂解法提取细菌和酵母菌的DNA可以满足菌株鉴定的要求。

图2 细菌B1 16S rDNA（A）和酵母菌F2 26S rDNA（B）的核苷酸测序峰图Fig.2 Nucleotide sequencing images of the 16S rDNA of strain B1（A）and the 26S rDNA of strain F2（B）

2.3 菌株鉴定结果分析

基于碱裂解法和试剂盒法对12株四川泡菜菌株的鉴定结果见表2。

表2 基于碱裂解法和试剂盒法对12株四川泡菜菌株的鉴定结果Table 2 Identification results of 12 strains obtained from Sichuan pickles by using alkaline lysis method and test kit method

可以看出，8株细菌和4株酵母菌均被鉴定到种，且同源性达到99%以上。采用碱裂解法对12株菌株的鉴定结果与采用市售试剂盒法的鉴定结果一致，表明基于碱裂解法提取细菌和酵母菌DNA的鉴定方法可行，且准确性高。四川泡菜中分离得到的8株细菌包括6株乳酸菌和2株肠球菌；4株酵母菌分别为胶红酵母、常威克汉姆酵母、热带假丝酵母和奥默柯达酵母[18-19]。

2.4 提取菌株DNA的耗时和成本分析

在测试成本方面，采用碱裂解法提取菌株DNA的成本仅为50元/100次，远低于试剂盒法（>600元/100次），见表3。

表3 采用碱裂解法和试剂盒法提取菌株DNA的成本和耗时分析Table 3 Cost and time-consuming analyses between alkaline lysis method and test kit method

这主要是由于碱裂解法中使用试剂为价格低廉的氢氧化钠和少量的聚醇类表面活性剂，而试剂盒法中采用价格较高的酶制剂[20]。在测试耗时方面，采用碱裂解法在准备阶段的耗时高于试剂盒法，但总耗时却较少（50 min），明显低于试剂盒法总耗时（125 min）。因此，碱裂解法是一种经济、快速的提取菌株DNA方法。

3 结论

基于碱裂解法提取菌株DNA鉴定四川泡菜中8株细菌分别为植物乳杆菌、乳酸乳球菌、短乳酸菌、假肠膜明串珠菌、柠檬明串珠菌、类肠膜魏斯氏菌、鹑鸡肠球菌和希氏肠球菌；4株酵母菌为胶红酵母、常威克汉姆酵母、热带假丝酵母和奥默柯达菌。该方法测试结果准确、操作简单、耗时少、成本低，适合于发酵食品中微生物的鉴定。

[1]陈功,夏友书,张其圣,等.从中国泡菜看四川泡菜及泡菜坛[J].中国酿造,2010,29(8):5-8

[2]熊涛,关倩倩,谢明勇.直投式与传统发酵泡菜工艺中病原菌的变化规律[J].食品科学,2012,33(13):140-143

[3]陈功,余文华,张其圣,等.四川泡菜与乳酸菌的研究[J].中国酿造,2012,31(9):151-153

[4]CHI Y L,ZHANG Q S,CHEN G,et al.Survival of Escherichia coli O157:H7,nitrite content and sensory acceptance of low-salt Chinese paocai fermented by screened lactic acid bacteria[J].International Journal of Food Science and Technology,2016,51:2178-2184

[5]蔡炯,迟原龙,汪冬冬,等.腐败四川泡菜菌相构成及主要腐败菌特性分析[J].食品科技,2017,43(1):279-283

[6]VAN BURIL J A,SCHRECKHISE R W,WHITE T C,et al.Comparison of six extraction techniques for isolation of DNA from filamentous fungi[J].Medical Mycology,1998,36:299-303

[7]MELO S C O,PUNGARTNIK C,CASCARDO J C M,et al.Rapid and efficient protocol for DNA extraction and molecular identification of the basidiomycete Crinipellis perniciosa[J].Genetics and Molecular Research,2006,5:851-855

[8]SAMBROOK J,RUSSELL D W.Molecular cloning:a laboratory manual(Third edition)[J].Cold Spring Habor Laboratory,2016,49:895-909

[9]HARUTA S,KONDO M,NAKAMURA K,et al.Microbial community changes during organic solid waste treatment analyzed by double gradient-denaturing gradient gel electrophoresis and fluorescence in situ hybridization[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2002,60:224-231

[10]TOFALO R,PERPETUINI G,SCHIRONE M,et al.Yeast biota associated to naturally fermented table olives from different Italian cultivars[J].International Journal of Food Microbiology,2013,161:203-208

[11]汪红,曹瑜,罗时宇,等.四川泡菜乳酸菌的分离鉴定及其特性研究[J].四川大学学报(自然科学版),2008,45(6):1509-1512

[12]王俊刚,刘成江,郭安民,等.分子生物学技术在乳酸菌鉴定中的应用[J].中国酿造,2012,31(1):1-4

[13]蒋云露,杨建涛,王猛,等.四川泡菜盐卤中微生物总基因组DNA提取方法的比较[J].中国酿造,2015,34(4):90-92

[14]肖其胜,杨捷琳,丁卓平,等.五种DNA提取方法对酸奶及菌粉中益生菌DNA提取效果比较[J].食品工业科技,2016,37(3):307-311

[15]徐晓宇,阂航,刘和,等.土壤微生物总DNA提取方法的比较[J].农业生物技术学报,2005,13(3):377-381

[16]安云鹤,高丽娟,李俊博,等.PCR扩增循环数对细菌群落多样性测序分析的影响[J].生物工程学报,2016,32(8):1115-1123

[17]董银萍,崔生辉,李凤琴,等.乳酸杆菌及嗜热链球菌的种水平鉴定——16SrRNA基因PCR扩增及序列分析[J].卫生研究,2010,39(4):454-458

[18]曾骏,陈安均,蒲彪,等.传统四川泡菜中酵母菌的动态变化规律[J].食品科学,2014,35(7):81-85

[19]刘春燕,戴明福,夏姣,等.传统四川泡菜发酵过程中酵母菌分离鉴定[J].食品工业科技,2015,36(5):171-174

[20]李会,任志莹,王颖,等.不同DNA提取试剂盒提取作物种子基因组DNA效果的比较[J].湖北农业科学,2013,52(8):1956-1958