魏敏，陈义坤，宋旭艳，罗诚浩，潘曦，黄龙

（湖北中烟工业有限责任公司技术中心，湖北武汉430040）

美拉德反应是指含有羰基的化合物和含有氨基的化合物之间经缩合、聚合等一系列反应而生成多种小分子风味物质及类黑精的复杂反应，也被称为棕色化反应或褐变反应[1]，使得食物可具有多种风味和色泽[2-3]。Kam Huey Wong等[4]详细地研究了葡萄糖与17种氨基酸在酸性条件下的美拉德反应呈味情况，发现脯氨酸可以产生令人愉悦的花香气味。冯洪涛等[5]、高徐梅等[6]进行了等摩尔比葡萄糖与脯氨酸在丙二醇水体系中的美拉德反应，分别采用同时蒸馏萃取GC/MS和GC/MS分别鉴定出19种、27种挥发性成分。固相微萃取法是目前复杂基体中痕量组分分析的主要前处理技术，其克服了水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法等传统处理时样品需求量大、耗时长等缺点，具有操作简单，选择性较好等特点[7－8]，目前广泛应用于酒类[9－11]、饮料[12]、茶叶[13]、中草药[14]、植物[15]、美拉德反应物[16]等挥发性成分分析及鉴定。本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用（HS-SPME-GC/MS）检测脯氨酸美拉德反应物挥发性香气成分，优化了固相微萃取条件，探讨脯氨酸美拉德反应物的高效、快速分析香味物质的方法及分析其挥发性香气物质，为其进一步开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 药品和仪器

脯氨酸美拉德反应物：由脯氨酸、葡萄糖按摩尔比2∶1，在水溶液中进行美拉德反应制备所得。

AHYQ HH-6数显恒温水浴锅：常州澳华仪器有限公司；CP 2202S-OCE 天平：Sartorius AG Germany；手动SPME进样手柄、手动萃取纤维头 [100 μm PDMS（聚二甲基硅氧烷）、65 μm PDMS/DVB（聚二乙烯基苯）、75 μm CAR（碳分子筛）/PDMS]、15 mL专用顶空萃取样品瓶：美国Supelco公司；TRACE GC Ultra-DSQⅡ型气相色谱/质谱（GC/MS）联用仪：美国热电科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SPME条件

称取脯氨酸美拉德反应物样品1 g，置于15 mL专用顶空萃取样品瓶中，插入已老化的3种不同萃取头，在一定温度下预平衡10 min，萃取一定时间，采用单因素试验法，通过评估萃取能力大小和萃取物质种类的多少，对萃取头的种类、萃取温度和萃取时间等条件进行优化。

萃取头选择：选用 100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 3种萃取头，分别以 250℃30 min、250℃ 30 min、300℃ 30 min条件下老化，插入装有脯氨酸美拉德反应物的15 mL专用顶空萃取样品瓶，在60℃萃取30 min后比较萃取结果。

萃取温度选择：采用最优萃取头分别在40、50、60、70、80℃温度下萃取30 min后比较萃取结果。

萃取时间优化：采用最优萃取头在最优萃取温度下分别萃取 30、40、50、60、70、80 min 后比较萃取结果。

1.2.2 GC/MS分析条件

1.2.2.1 色谱条件

柱初温50℃，保持2 min，以8℃/min的速率升温到180℃，保持1 min，再以18℃/min的速率升温到280℃，保持 30 min；载气为氦气（He，纯度 99.99%），恒流模式，流速为1.0 mL/min；分流进样方式，分流比1∶10，无溶剂延迟；进样口温度250℃。

1.2.2.2 质谱条件

电离方式：EI源；电子能量：70 eV；倍增管电压：1.2 kV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；接口温度：280℃，传输线 280℃；扫描范围：33 m/z～350 m/z。使用NIST标准谱库进行检索分析，按峰面积归一化法计算化合物相对百分含量。

2 结果与分析

2.1 萃取条件优化

2.1.1 萃取头的选择

不同材质的萃取头对不同化合物的萃取率不同，因此萃取头的选择对挥发性化合物的分析结果有重要影响。萃取头的萃取效果主要受萃取头涂层极性与表面积的影响。非极性涂层可有效萃取非极性化合物，极性涂层可有效萃取极性化合物。比较分析选用不同萃取头时美拉德反应物挥发性风味物质的萃取结果见表1。

表1 3种萃取头的萃取效果Table 1 Extraction efficiencies of three SPME fibers

结果显示，3种萃取头中，100 μm PDMS萃取头的萃取量较大，且有效峰较多，其次是65 μm PDMS/DVB和75μm CAR/PDMS。因此选取100 μm PDMS萃取头。

2.1.2 萃取温度的选择

温度对萃取头的萃取效果有双重影响，温度升高时，有利于分析物在基质中的扩散，缩短萃取时间，但升高温度也会使分析物在涂层中的分配系数降低，导致吸附量减小，影响萃取头的灵敏度。比较分析不同萃取温度条件下脯氨酸-葡萄糖美拉德反应物挥发性风味物质的分析结果，见表2。

结果显示，80℃条件下的萃取峰面积最大，且得到的有效峰最多，说明脯氨酸-葡萄糖美拉德反应物的挥发性成分在80℃条件下的萃取效果最佳；温度较低时，可能该美拉德反应物中挥发性成分挥发的速度较慢或不完全挥发；而温度更高时，可能是挥发性物质在萃取头涂层中吸附量下降所致。因此，试验选择将80℃作为此次美拉德反应物挥发性成分的萃取温度。

表2 萃取温度的选择Table 2 Selection of extraction temperature

2.1.3 萃取时间的选择

比较分析不同萃取时间条件下脯氨酸-葡萄糖美拉德反应物中挥发性成分的分析结果，见表3。

结果显示，就总峰面积而言，随着萃取时间的延长，总峰面积明显增加，当萃取时间超过60 min后，总峰面积变化不再显著。从有效峰个数上看，萃取时间超过60 min后，有效峰个数变化不大，说明超过一定时间后萃取时间的延长对有效峰个数的影响不大。综合以上结果，选择60 min作为此次美拉德反应物挥发性成分萃取试验的萃取时间。

表3 萃取时间的选择Table 3 Selection of extraction time

2.2 脯氨酸美拉德反应物挥发性成分分析

根据上述所得的最佳萃取试验条件（100 μm PDMS萃取头，80℃下萃取60 min），以脯氨酸美拉德反应物为研究对象，采用HS-SPME-GC-MS检测分析，见表4。

表4 脯氨酸美拉德反应物HS-SPME-GC/MS分析Table 4 HS-SPME-GC/MS results of the volatile compounds in Proline-Glucose Maillard reaction products

续表4 脯氨酸美拉德反应物HS-SPME-GC/MS分析Continue table 4 HS-SPME-GC/MS results of the volatile compounds in Proline-Glucose Maillard reaction products

从表4可以看出，采用HS-SPME-GC/MS方法从脯氨酸美拉德反应物中共鉴定出76种挥发性成分，按照面积归一化法来计算这76种挥发性成分的相对百分含量为74.42%，包括醛类3种（42.94%），杂环化合物 15种（6.92%），酯类 15种（9.29%），醇类 14种（5.98%），烃类 13种（3.91%），酮类 7种（2.74%），酸类6种（1.87%），烯类3种（0.77%）。就单一物质而言，5-（1-哌啶）-2-呋喃甲醛最高，为 35.38%，其次是5-羟甲基糠醛7.04%、邻苯二甲酸乙酸异丁酯3.23%、庚酸酐1.83%、（Z）-9-十六碳烯酸甲酯1.66%、十六醇1.39%、3-羟基-a-二氢突厥酮1.02%等。其中5-（1-哌啶）-2-呋喃甲醛是本试验脯氨酸-葡萄糖美拉德反应物挥发性成分中相对含量最高的物质；5-羟甲基糠醛是由葡萄糖等单糖化合物在高温等条件下脱水生成的具有呋喃环结构的醛类化合物，是美拉德反应的典型产物之一[17]，广泛存在于食品中，对血管内皮细胞和小鼠四氯化碳肝损伤模型具有保护作用[18]，也是2，5-呋喃二甲醛等的转化前体物质；辛酸奶酪味，腐败味，涩味，稀释后呈水果香气；柠檬烯是烷烃中阈值较低的一种“活性气味物质”，具有清新的柠檬香和柑橘香[19]；β-广藿香烯是倍半萜类成分；庚酸丁酯呈草药和弱的生苹果似水果香味；2，6，10-三甲基十四烷等支链烷烃拥有一定的香气特征；月桂酸干果味、肉豆蔻酸等饱和脂肪酸，可赋予烟气一种腊味、脂味和柔和的吸味；月桂酸乙酯具有特有的花果香气，十六烷醇具有玫瑰香气；棕榈酸乙酯有脂肪味，腐败味，水果味，甜味等。

3 结论

采用HS-SPME-GC/MS方法分析脯氨酸-葡萄糖的挥发性成分，对SPME条件包括萃取头的选择、萃取温度时间进行了优化，最佳萃取试验条件（100 μm PDMS萃取头，80℃下萃取60 min）进行了检测分析，美拉德反应物的挥发性成分出峰时间集中在10 min～24 min之间，总共鉴定出76种化合物，这些挥发性成分构成了该脯氨酸美拉德反应物的特殊风味，为其进一步开发利用提供理论基础和科学依据，对美拉德反应物高效、快速分析香味物质提供一定参考。

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