响应面分析法优化槐米中芦丁提取工艺

2018-01-17邱岚梁琍邱学云付素静

食品研究与开发 2018年2期

邱岚，梁琍，邱学云，付素静

（铜仁学院农林工程与规划学院，贵州省梵净山特色动植物资源重点实验室，贵州铜仁554300）

芦丁（Rutin），又名芸香苷（5，7，3c，4c，-四羟基-3-芸香糖黄酮），为黄酮类化合物广泛存在于多种药材和食材中，豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾即槐米（flossophorae）中尤为丰富，且具有较高的利用价值，在药用方面，用于预防和治疗糖尿病及合并高血脂症，同时还有抗炎、抗病毒等作用[1]。芦丁可改变细菌的细胞内、外膜的渗透性而使细胞膜受到破坏[2]，因此有抑菌、抗氧化的等作用。另外，在食品、化妆品登方面应用也很广泛。国外也常用芦丁做食品及饮料的染色剂[3]，除此之外，可用作抗氧剂及天然食用黄色素。另外，芦丁对紫外线有较强的吸收作用，能吸收A区（波长320 nm～400 nm）紫外线，所以芦丁可单用或与黄芩苷[能吸收B区（波长280～320 nm）紫外线]合用，作防晒霜的主要成分[4]。因此，在化妆品行业具有广阔的应用前景。

目前，人们对槐米中芦丁的提取方法已有部分研究，如舒晓宏等[5]对槐花米中芦丁提取最佳pH值的实验研究。张来新[6]主要对槐花米中提取芦丁的几种方法比较。如“水提法”，“碱水（石灰水）提取法”，“有机溶剂（乙醇）回流法”。除此之外，对槐米中芦丁的提取方法还有采用碱提酸沉法[7]，渗漉法[8]，微波辅助提取法[9]、“超声波法[10]”进行提取。但各种方法均各有不足，即存在浪费材料、条件难控制、提取率低，或是仅在单因素上进行研究，没有对超声提取条件进行优化，或未考虑芦丁分子因含有邻二酚羟基而在碱性条件下更易氧化分解对提取率产生影响等问题。廖华卫等[11]虽然利用正交法对槐米中芦丁的提取进行优化，可是仍用煎煮的方法提取，也存在成本高，得率低的缺点。因此为了缩短提取时间、降低成本、提高产率，本试验采用超声辅助提取综合碱溶酸沉的原理提取槐米中的芦丁，通过响应面试验优选出最佳的提取工艺。响应面法最早出现在1951年，由英国的两位学者Box和Wilson提出。是利用统计软件进行合理的实验设计[12]，采用多元二次回归方程将多因素试验中的各因素与指标的相互关系进行拟合，通过对试验建立数学模型然后进行分析研究因素与响应面之间、因素与因素之间的相互关系，从而来优化工艺参数的统计分析方法。其优点在于试验次数少，试验精度高[13]，且适合于多因素、多水平的试验，弥补了正交优化法只能考虑单一因素对提取率的影响，并且得到国内外科研学者的广泛利用。

铜仁学院校园内乃至整个铜仁地区每到春天都开满了槐花，弥漫着槐花的香味，而目前为止它们大多都被当作行道树，仅仅体现其园林应用价值，对槐米中芦丁的提取工艺及芦丁药用和在化妆品行业中利用价值的开发研究却还比较少。本项目对铜仁学院槐米中芦丁提取工艺进行探索研究，为今后进一步合理开发槐米资源提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

槐米采自铜仁市铜仁学院老校区，干燥后室温密封保存。

1.1.2 试剂

无水甲醇：天津市富宇金细化工有限公司；亚硝酸钠溶液：天津市博迪化工有限公司；硝酸铝溶液：天津市密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠溶液：天津市石英终厂霸州分厂；盐酸溶液：衡阳市凯信试剂有限公司；硼砂：天津市巴斯天化工有限公司；亚硫酸氢钠：天津市博迪化工有限公司；芦丁标准品：北京化学试剂公司；蒸馏水。

1.1.3 仪器

FW80高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；101-3型电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；GUTEL超声波清洗器：上海冠特超声仪器有限公司；W201B恒温水浴锅：上海申顺生物科技有限公司；TDL-5台式离心机：上海安亭科学仪器厂；KQ-C玻璃仪器气流烘干器：巩义市予华有限责任公司；PL602-5电子分析天平：奥豪斯仪器上海有限公司；SHZ-DIII予华牌循环水真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

将采摘后的槐花蕾除去杂质、枝条、梗，即刻于110℃烤箱内杀青再调温到60℃烘干至恒重，经万能粉碎机粉碎获得槐米粉末，粉末于室温下密封保存。

1.2.2 超声波辅助提取槐米芦丁及得率测定

采集槐米样品→干燥→粉碎→按一定的料液比加溶剂（并加入硼砂、亚硫酸氢钠）→调pH值（8～9）→超声波辅助提取→过滤→滤液盐酸调pH值（2～3）→静置→抽滤→干燥→芦丁粗提物。

称取芦丁粗品→加甲醇溶解并定容→量取经稀释后的样品液→加入5%亚硝酸钠溶液→10%硝酸铝溶液→4.3%氢氧化钠→加蒸馏水定容至25 mL→揺均放置→500 nm波长下吸测定光值[14]。

1.2.3 标准曲线的绘制

准确称取芦丁标准品2 mg，置于10 mL容量瓶中，加入一定量甲醇，水浴微热溶解后，放冷，继续加甲醇溶液至刻度，摇匀。精密吸取2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀即得芦丁标准液（含量为0.2 mg/mL）。分别精密量取上述标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL与6.0 mL置于6个25 mL容量瓶中，并加水至6mL，之后加入5%亚硝酸钠溶液1 mL摇匀（放置6 min），再加入10%硝酸铝溶液1 mL摇匀（放置6 min），然后加入4.0%NaOH溶液10 mL，最后加水至刻度，摇匀，静置15 min，于紫外分光光度仪中，在500 nm的波长[15]下测定芦丁标准品的吸光值，并以标准溶液的含量为横坐标，吸光度为纵坐标，制得作标准曲线图（见图1）依图得到的趋势线回归方程为：Y=16.429x+0.021 6，R2=0.998（n=6）。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.4 样品芦丁含量的测定

芦丁提取率计算公式为：

式中：A为提取芦丁溶液的吸光度；M为槐米干粉，g；M1为称取的干燥芦丁粗品，g；M2为提取的总干燥芦丁粗品，g。

1.2.5 单因素试验

选取料液比、超声波时间、超声次数为单因素，分别依次按照1.2.2进行槐米中芦丁提取的单因素试验。

1.2.6 响应面优化试验设计

在单因素的试验基础之上，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，利用Design-Expert.V8.0进行三因素三水平响应面分析法[16]。以100 W的超声波固定功率，选取料液比（A）、超声波时间（B）、超声波次数（C）为自变量，芦丁提取率（Y）为响应值。进行优化超声波提取芦丁的工艺条件[14]。各因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 The response surface test factors level tables

1.2.7 数据的处理与分析

标注曲线制作及单因素试验数据是采用Origin pro7.5处理。响应面优化试验数据采用Design-Expert.V 8.0进行分析处理和作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对芦丁提取率的影响

准确称取5.00 g槐米粉末5份，分别放入锥形瓶中按 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）的料液比加入蒸馏水，在室温下放入超声波装置中，室温下超声时间20 min，超声固定功率100 W，超声提取2次，最后得到最佳的料液比，平行试验3次，求平均值。试验结果见图2。

图2 料液比对芦丁提取率的影响Fig.2 Effects of liquid ratio on rutin yield

由图 2 看出，料液比在 1 ∶5（g/mL）～1∶15（g/mL）之间，料液比增加，芦丁提取率也随着增加，在1∶15（g/mL）时达到最大值，在此之后料液比逐渐增大芦丁提取率出现下降趋势，其原因为在芦丁提取全过程中，原料及成品总会有损失，料液比越大，损失越严重，而在1∶15（g/mL）时提取芦丁的量达到最大，故在 1 ∶15（g/mL）是芦丁提取最适合的料液比，提取率达到最大值。

2.1.2 超声提取时间对芦丁提取率的影响

准确称取5.00 g槐米粉末5份，分别放入锥形瓶中，按1∶15（g/mL）料液比加入蒸馏水于室温下放入超声波，超声时间为 5、10、20、30、40 min，超声波固定功率为100 W，超声提取2次，最后得到最佳的超声提取时间，平行试验3次，求平均值。试验结果见图3。

图3 提取时间对芦丁提取率的影响Fig.3 Effect of time on rutin yield

由图3看来，在20 min之前，芦丁提取率随时间增长而增加，其原因是超声辐射时间过短，未能很好地使原料细胞壁被破坏，依此推理，若超声辐射时间越长，芦丁提取率将会不断提高，而从图中可知在20 min时芦丁提取率最大，之后芦丁提取率呈下降趋势，这是由于原材料在超声辐射下时间越长，空化作用越明显即是会形成越细的颗粒，在过滤的环节中则造成更多损失，从而造成芦丁提取率下降[17]。

2.1.3 超声提取次数对芦丁提取率的影响

准确称取5.00 g槐米粉末5份，分别放入锥形瓶中，按1∶15（g/mL）料液比加入蒸馏水于室温下放入超声波，超声时间为20 min，超声波固定功率为100 W，超声次数分别是1次、2次、3次、4次、5次，最后得到最佳的超声提取次数，平行试验3次，求平均值。试验结果见图4。

图4 提取次数对芦丁提取率的影响Fig.4 Effect of number of extraction times on rutin yield

从图4可知，超声波辐射1次芦丁提取率明显较低，辐射2次提取率达最大值，随后超声辐射次数增多芦丁提取率却未增加，其原因有提取次数增多提取液渐渐黏稠过滤困难造成材料的大量损失，另外，当超声辐射次数增多，按理说提取率应该不断增大然后不变，实际上随提取次数的增多，芦丁会被氧化的量就会增大，从而造成芦丁提取率降低[18]。

2.2 响应面法优化槐米中芦丁超声提取工艺

2.2.1 响应面优化试验设计及结果

为了优化超声提取芦丁的最佳工艺条件。以料液比（A）、超声提取时间（B）、超声提取次数（C）为自变量，以芦丁提取率（Y）为响应值，进行三因素三水平响应面分析试验[19-20]，试验设计方案及结果见表2。共17个试验。1～12为析因试验，13～17为中心试验，用以估计试验误差，方差分析见表3。回归模型可靠性分析见表4。

表2 响应面试验设计及试验结果Table 2 The results and experimental designs of the response surface

表3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance of the regression equation

表4 回归模型可靠性分析Table 4 Credibility analysis of the regression model

利用响应面分析法优化超声辅助提取槐米中芦丁的工艺参数，并采用Design Expert V 8.0软件进行分析，结果见表2，对表2结果进行统计分析，可建立如下多元二次回归方程：Y=17.97+0.74A+0.36B+0.41C-0.073AB+0.14AC-0.69BC-1.79A2-1.32B2-1.23C2，对二次回归方程进行方差及可靠性分析，结果见表3、表4，从表3可知，该二次回归方程的一次项、二次项及交互项中的 A、B、C、A2、B2、C2、BC 均表现出了显著水平，该二次回归方程整体模型比较显著，并且失拟项不显著，该回归模型与实测值能较好地拟合。

2.2.2 响应面分析

为了考察交互项对提取率的影响，在其他因素条件不变的情况下，考察交互项对提取率的影响，对模型进行降维分析，经Design-Expert V 8.0软件分析所得的响应面图见图5。

图5 料液比、超声时间、超声次数对芦丁提取率交互影响响应面图Fig.5 Response surface plot showing the effects of interaction between solid-liquid ratio，ultrasonic time and ultrasonic times on the yieid of rutin

由图5可知，随着每个因素的增大，响应值增大，当响应值增大到极限值后，随着因素的增大，响应值逐渐减小；在交互项BC交互作用明显，与方差分析结果一致。影响超声提取槐米芦丁的主次因素为A>C>B，即料液比>超声提取次数>超声提取时间。

2.2.3 最佳工艺的确定

通过Design-Expert V 8.0 RSM计算出最佳提取工艺条件和芦丁提取率最大值，最佳提取条件为料液比1 ∶16.06（g/mL）、超声提取时间 20.90 min、超声提取次数2.16次，理论提取率为18.09%。并根据实验室条件将最佳提取工艺条件进行修正[21]，修正后的提取条件为料液比 1 ∶16.00（g/mL）、超声提取时间 20.00 min、超声提取次数2.00次。在修正后的条件下，重复试验5次测芦丁的提取率，并计算RSD试验条件与结果见表5。

表5 验证试验结果Table 5 Verification testing results

由表5可知，根据实验室条件在最佳提取工艺条件下重复试验，芦丁提取率为17.96%，接近理论提取率18.09%，RSD为1.15%，说明响应面法建立的槐米中芦丁的提取数学模型具有稳定可靠性，试验结果与模型符合良好。

3 结论与讨论

在单因素试验的基础上，采用Design-Expert V 8.0软件中的Box-Behnken（BBD）中心组合原理设计响应面试验以及响应面分析法，建立了以料液比（A）、超声提取时间（B）、超声提取次数（C）为自变量，槐米芦丁提取率为响应值（Y）的多元二次回归数学模型、方差和可信度分析，回归决定系数达0.969 3，回归模型极显著，无失拟项，根据优化条件进行验证试验，取料液比1 ∶16（g/mL）、超声提取时间 20 min、超声提取次数2次，提取率为17.96%与预测值相差较小，RSD为1.15%，说明响应面法建立的槐米中芦丁提取率数学模型对槐米中芦丁提取具有稳定可靠性，因此该提取条件合理可行。本次研究采用超声波提取槐米中芦丁，提取原理则是基于超声波的空化作用和芦丁的碱溶酸沉，即是将二者相结合，利用响应面法来优化提取槐米中芦丁的最佳工艺。与正交设计比较，正设计法只能从预先设计的几个水平中优化组合，所得的最佳工艺条件只是理想条件，不是真实意义的最佳条件。因此，采用RSM法优化得到的提取条件可靠准确，具有实用价值。与传统的“水提法”、“碱提法”、“微波辅助提取法”等方法相比，超声辅助提取法提取率高，其原因可能是，以上几种提取方法未能很好地使植物细胞内的芦丁最大限度溶于提取溶剂中，而超声波具有空化作用，因此超声辅助提取法即在芦丁溶于提取溶剂中占优势。与马国刚[18]、萨燕平[22]、郭乃妮[23]等的超声辅助提取的研究相比，本研究使用的超声清洗器频率和功率与之不同，且对芦丁提取的影响因素选择，提取溶剂，碱提或酸沉过程中pH值的大小（碱提为8～9，酸沉为2～3较好），原料粒度，原料产地及采取时间都有差异。

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