纪忠伟 杨羽茜 李胜龙 张博淼 李云龙 黄跃南

结直肠癌是世界上常见的恶性肿瘤，早期结直肠癌（Ⅰ期和Ⅱ期）患者的5年生存率在60%以上；50%以上的患者在确诊时已经发生远处转移（为Ⅲ期或Ⅲ期以上），5年生存率下降到10%，化疗和手术治疗仍是重要的治疗手段，也是提高生存率的唯一途径［1］。奥沙利铂（oxaliplatin）是常用于结直肠癌化疗的第三代铂类药物，然而，结直肠癌化疗无效的一个重要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生耐药。

一、奥沙利铂在结直肠癌化疗中的耐药机制

奥沙利铂是第三代铂类药物，常用于结直肠癌、胃癌、胰腺癌的化疗，通过主动转运进入细胞，与细胞内的亲核分子结合，主要是DNA，也与RNA和蛋白质结合，在两个邻近的鸟嘌呤之间或鸟嘌呤与腺嘌呤之间形成链内加合物，而破坏DNA复制和转录［2］。在结直肠癌化疗中，奥沙利铂耐药的分子机制主要涉及核酸切除修复系统（nucleic acid excision repair system，NER）、微小RNA、细胞膜表面三磷酸腺苷结合盒转运体（ATP-binding cassette transporters, ABC转运体）等。

1.NER：NER是高度保守的DNA修复途径，修复DNA损伤，改变DNA分子的螺旋结构并干扰DNA复制和转录。该系统修复过程的重要步骤包括识别DNA受损特定区域的损伤和分界，形成复合物以解开受损部分并将其切除，最后，切除后的区域被重新正确合成并连接以保持DNA分子的完整［3］。在体内顺铂和奥沙利铂导致的DNA损伤能被NER系统修复，NER系统中核酸切除修复交叉互补因子-1和其催化因子XPF（ERCC4）在核苷酸切除修复中起着重要的作用，被证明参与奥沙利铂的耐药［4］，其它蛋白如XPF和XPG（ERCC5）也与奥沙利铂耐药有关。但也有研究表明，修复交叉互补因子-1水平降低与奥沙利铂诱导的细胞周期阻滞有关，与耐药性的产生或DNA修复能力的改变无关［5］，因此仍需要进一步研究。

2.微小RNA（MicroRNAs）：MicroRNAs（miRNA）是非编码RNAs，通过模板序列以碱基互补的方式结合到靶信使RNAs上，导致靶信使RNAs降解或转录抑制。研究表明miRNAs突变与人类肿瘤获得性耐药密切相关，在体外过度表达miR-153，miR-203，miR-143，通过相应地调整FOXO3a，ATM激酶和IGF-1R而影响奥沙利铂的耐药性［6］。临床试验中，结直肠患者血浆中过度表达miR27b和miR-148a，与以奥沙利铂为基础的一线化疗耐药和无进展生存期缩短相关，而过度表达miR-326与总体生存率下降相关［7］。

3.细胞膜表面ABC转运体（ABC transporters）：肿瘤细胞药物流出转运体ABC家族在转出细胞内的化疗药物方面起着重要的作用，特别指出的是ABC亚家族，包含多药耐药相关蛋白已经证明参与铂类药物的耐药［8］，在体外卵巢癌模型中，多药耐药相关蛋白1和多药耐药相关蛋白4能增加ABC转运体的基因表达及与氨基端相关的糖基化，这对减少癌细胞中化疗药物的累积及增加对化疗药物的耐药性起着重要作用［8］。

以奥沙利铂为基础的化疗方案目前已成为转移性或晚期结直肠癌化疗的标准方案。然而，单独使用奥沙利铂在体内并没有显示出足够高的抗肿瘤活性，主要归因于静脉给药后人体对药物有剂量限制性的毒副作用，药物在肿瘤组织的累积浓度低，以及肿瘤细胞对药物的耐药。一般而言，癌症化疗的效果受到化疗药物对正常细胞和组织的毒副作用以及多药耐药发展的限制，这些局限性是由于抗肿瘤药物对肿瘤细胞缺乏选择性以及它们对靶组织的低递送率。iRGD肽作为一种靶向肽与化疗药物结合，可以使化疗药物最大化地递送到肿瘤组织内，同时使其在正常组织中的累积和毒性最小化。

二、iRGD肽的结构及逆转肿瘤耐药机制

iRGD是肿瘤组织特异性穿透肽，通过荷瘤鼠体内噬菌体文库筛选出来，具有靶向特定肿瘤的能力，已经证明能选择性递送化疗药物和显像剂至肿瘤的特定部位［9-10］。iRGD肽包含两个氨基酸基序，即RGD基序和R/KXXR/K基序（即CendR基序），由9个氨基酸组成，即CRGDKGPDC，易与靶肿瘤细胞表面的神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP-1）受体结合，增加对靶肿瘤细胞膜的通透性［11-12］。静脉注射iRGD后，iRGD与在肿瘤脉管系统中特异性表达的αv整联蛋白结合，然后被水解加工成CRGDK/R，在C-末端暴露出活性的CendR基序，CendR基序与NRPS相互作用，激发穿过组织的主动容量转运系统（active bulk transport system），使结合iRGD的药物甚至游离但与iRGD共同施用的药物在肿瘤组织内渗透和扩散［9，12］。首先，RGD 基序与整合素的 αvβ3和αvβ5受体结合，而这些受体主要在肿瘤内皮细胞中表达，在肿瘤的其他细胞中也有表达，这很可能使iRGD肽在肿瘤组织的扩散中起重要作用，而血管内皮是iRGD肽进入肿瘤细胞的大门。其次，蛋白酶切割事件（Protease cleavage event）激活CendR基序（R/KXXR/K），这种蛋白酶没有被确定，可能是弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样酶，因为CendR基序是这些蛋白酶首选识别基序。组织穿透肽一致通过R/KXXR/K基序与NRP结合，增加血管渗透性和分子通过组织的转运。R/KXXR/K基序不具有活性，除非它占据肽的C端位置，因此称为C-end Rule基序（CendR motif）［13］。CendR基序是这些蛋白酶的首选识别基序，蛋白酶切割需要与整合素结合，而有CendR基序但不与整合素结合的肽类是无作用的，因此与整合素结合的前提限制了iRGD肽靶向肿瘤的作用。最后，CendR基序结合NRP-1或神经纤毛蛋白-2（NRP-2），进而激活内吞作用/胞吐转运通路，此通路即为CendR通路［11，13-14］。此通路由iRGD激发，在增强化疗药物向肿瘤组织递送中起重要作用，而NRP-1和NRP-2是调节血管通透性的关键分子［15］。

三、CendR通路的细胞生物学

CendR通路始于细胞的内吞作用步骤，该步骤与已知的内吞细胞通路明显不同。CendR内吞囊泡与巨噬细胞囊泡最相似，但与经典的巨胞饮不同，因为CendR通路需要神经纤毛蛋白受体，另一明显区别是CendR通路通过细胞和组织的营养缺乏来提高活性，在营养素供应丰富的情况下，反应低下，营养物质通过中心营养感受器mTOR发挥其对CendR通路的作用［16］。CendR通路的mTOR调节主要通过调节NRP-1的表达来发挥作用。尽管营养素缺乏增强了通路的活性，但实际仍需要通过NRP-1激发。在mTOR活性较高的肿瘤中，mTOR调节CendR通路的一个必然结果是iRGD不能有效地将药物输送到具有高水平mTOR活性的肿瘤中，mTOR抑制剂雷帕霉素（rapamycin）与iRGD肽结合能增加肿瘤中CendR通路的递送效率［16］。

当CendR通路处于激活状态时，形成的内吞囊泡很大，平均直径约200 nm，可以容纳相当数量的细胞外液，如果细胞外液中含有化疗药物，和纳米颗粒一样作为荷载物储存在这些内吞囊泡中，必要时大量释放到通路中，这种情况说明了CendR通路的一个重要特点，除了共价连接的有效荷载物外，也能转运与iRGD肽一起施用但不与其结合的有效荷载，即旁观者效应（by-stander effect）［17］。iRGD荷载在肿瘤组织中的传递意味着能将有效载荷从一个细胞递送到另一个细胞。CendR通路是一个主动转运通路，需要消耗能量［18］，细胞与细胞之间CendR通路荷载物的转运已经在培养的肿瘤细胞和内皮细胞中证实［18］，最初的内吞过程很好理解，但是细胞间转运的途径和分子机制的信息很少。从已经摄取CendR通路有效荷载的细胞释放的外泌体含有效荷载，表明外泌体转运作为细胞间转运的一种机制，即使在有能溶解纳米颗粒但不渗透膜的化合物存在下，银纳米颗粒也可以从一个细胞转运到另一个细胞，这与CendR有效载荷受到生物膜（如外泌体）保护的观点一致。另一种假设细胞间转运是通过微米或纳米管来完成的，已经证明在肿瘤细胞之间或肿瘤细胞和内皮细胞之间管状导管的存在，细胞内的大分子通过这些导管从一个细胞转运到另一个细胞［19-20］。在短距离内通过这些管道传输的效率比外泌体传输更高［20］，这种机制可以解释CendR通路跨组织转运的有效性和传输速度。

iRGD肽通过与神经纤毛蛋白（neuropilin，NRP）相互作用增加肿瘤血管通透性将药物递送到血管外肿瘤组织中。在iRGD中的两个活性基序中，NRP结合的CendR基序在抗转移方面起重要作用，而整合素结合的RGD基序似乎只是将肽带到肿瘤组织或细胞中，因为没有CendR基序的RGD肽缺乏抗转移活性［13］。NRP-1和NRP-2在肿瘤细胞中高度表达，并且已经证实在肿瘤转移中起作用［12，15］。iRGD结合NRP-1和NRP-2，抗肿瘤转移可能是通过两种NRPs共同作用的结果。其抗转移作用由NRP结合的CendR基序介导，而不是由与整合素结合的RGD基序介导。iRGD抑制肿瘤细胞的迁移并引起体外化学排斥依靠CendR和NRP-1，该肽引起细胞急剧崩溃和部分细胞脱离，导致驱避活性，表明CendR在整联蛋白功能调节中起重要作用［17］。当该肽用于药物递送至肿瘤的靶向肽时，iRGD的抗转移活性可以提供显著的附加益处。

研究表明肿瘤细胞迁移是转移级联的关键步骤，涉及细胞突起的动态调节，细胞突起介导细胞粘附，提供移动的牵引力，并感知吸引或排斥细胞的环境信号。一些细胞迁移抑制剂通过折叠额细胞突起来消除前向牵引，帮助细胞改变方向，起到化学治疗剂的作用。包括天然CendR分子Semaphorin 3A（Sema 3A）在内的各种化学治疗药物通过抑制肿瘤侵袭来抑制转移［22］。iRGD肽，是一个有力的转移抑制剂，通过CendR基序结合NRP-1抑制肿瘤细胞迁移和化疗耐药，活细胞成像研究表明，iRGD提供了收回细胞突起的线索，并且一致地排斥了迁移的肿瘤细胞群，该作用依赖NRP结合CendR基序，因为CRGDC（非CendR对照肽）无效，并且iRGD在Transwell测定中的化学诱导被阻断性抗NRP-1b1b2抗体显著抑制［21］。这些发现证明了iRGD的CendR依赖性化学倾向性质，并提供了抗转移作用的潜在机制。

综上所述，iRGD肽通过穿透效应、滞留效应以及主动靶向作用，将化疗药物特异地递送到肿瘤组织内，最低限度地降低化疗药物在正常组织细胞内的累积，降低药物的毒副作用，增强化疗效果。研究表明，当iRGD肽用作化疗药物递送的辅助疗法时，将同时发挥抑制肿瘤转移的作用。iRGD的抗转移作用可以用于预防初始转移，抑制已发生转移的再转移，以及克服抗血管生成疗法中的促转移副作用［21-23］。目前研究仅在动物实验模型和细胞培养上，但是人类肿瘤对iRGD肽增强治疗的真正效果只能在临床试验中确定，有待于进一步研究。