苗智+马养民+孔阳+闫梦茹+王健

摘要： 为进一步开发和利用夹竹桃的内生真菌，对1株分离自夹竹桃茎部链格孢属内生真菌的代谢产物进行研究。利用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱等方法对该菌株的发酵产物进行分离，再经过重结晶纯化，得到5个生物碱类化合物。对所得化合物的理化性质和 1H-NMR、13C-NMR数据进行分析，确定这5个化合物的结构。采用最小抑菌浓度法和DPPH自由基法对所得化合物进行抑菌活性和抗氧化活性测试。结果表明，这5个化合物分别为次黄嘌呤（1）、腺嘌呤（2）、尿囊素（3）、胸腺嘧啶脱氧核苷（4）、尿嘧啶核苷（5）。其中，化合物1、3、4、5 为首次从链格孢属真菌的发酵物中分离得到。化合物3（尿囊素）具有一定的抑菌活性和抗氧化活性，化合物2（腺嘌呤）具有一定的抗氧化活性。夹竹桃链格孢属内生真菌具有一定的开发和利用价值。

关键词： 夹竹桃；链格孢属；内生真菌；重结晶；生物碱类；抑菌活性；抗氧化活性

中图分类号： S182 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0314-03

生物碱类化合物是指生物体内一类除了氨基酸、肽类、蛋白质和维生素B以外含氮原子的有机化合物的总称[1]。自19世纪初期出现关于生物碱的报道，至今已有200多年的历史。现已发现1万多种生物碱类化合物，它们具有抗菌[2-3]、抗氧化[4]、抗肿瘤[5-6]等生物活性。内生真菌是指全部阶段或一定阶段生活在健康植物组织内，对植物组织没有造成明显病害的真菌[7]，它们能够产生生物碱类、黄酮类、萜类、甾体类、醌类、苯丙素类、肽类等多种类别的次生代谢产物，具有多种多样的生物活性[8]，在医药和农业等行业中具有重大的应用价值。因此，研究植物内生真菌的活性成分具有十分重要的意义。夹竹桃（Nerium indicum）是夹竹桃科夹竹桃属植物[9]，是强心类中药，主要有强心利尿、镇痛、祛痰定喘、祛瘀等功效[10]。 目前，国内外对夹竹桃的研究多集中于其植株的化学成分，对其内生真菌代谢产物的报道甚少。笔者所在课题组从夹竹桃植物中分离得到35株内生真菌，并对1株分离自茎部的内生真菌J14菌株进行研究，从其发酵产物中分离得到8个化合物，其中含有3个生物碱类化合物，分别为胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤[11]。因此，本试验继续对该菌株的生物碱类代谢产物进行研究，以丰富国内外对夹竹桃内生真菌代谢产物的研究，为进一步开发和利用夹竹桃内生真菌奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

内生真菌J14菌株，分离自秦岭地区夹竹桃的茎部，经鉴定为链格孢属真菌，4 ℃条件下保存于笔者所在实验室。

1.2 试验仪器和试剂

SW-CJ-1FD 超净工作台，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；YX280B 手提式压力蒸汽灭菌锅，购自上海三申医疗器械有限公司；DH5000B 电热恒温培养箱，购自天津市泰斯特仪器有限公司；HZQ-Q 全温数显振荡器，购自江苏省金坛市瑞华仪器厂；BS224S 电子天平，购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；RE52CS-1 旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；Bruker avance Ⅲ-400 Hz 超导核磁共振仪，购自布鲁克（北京）科技有限公司；XT-5 显微熔点测定仪，购自北京市科仪电光仪器厂；柱色谱硅胶200 ～ 300目，购自青岛海洋化工厂分厂；柱色谱凝胶Sephadex LH-20，购自上海浩然生物技术有限公司；薄层色谱硅胶G，购自青岛海浪硅胶干燥剂厂；试验所用化学试剂均为國产分析纯试剂。

1.3 培养基

马铃薯葡萄糖液体培养基：20 g葡萄糖、1 000 mL 20%马铃薯浸汁，pH值自然；牛肉膏蛋白胨液体培养基：10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g NaCl、1 000 mL H2O，pH值自然；大米培养基：75 g大米+无糖察氏液体培养基（0.3 g NaNO3、0.1 g K2HPO4、0.05 g KCl、0.05 g MgSO4·7H2O、0.001 g FeSO4、1 00 mL H2O，pH值自然）。

1.4 测试菌

细菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、乳酸链球菌（Streptococcus lactis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）；植物病原菌真菌：小麦赤霉病病菌（Fusarium graminearum）、番茄灰霉病病菌（Botrytis cinerea）、烟草赤星病病菌（Alternaria alternata）、白菜黑斑病病菌（Alternaria brassicae）、辣椒疫霉病病菌（Phytophthora capsic）、苹果树腐烂病病菌（Valsa mali）、葡萄炭疽病病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、芍药炭疽病病菌（Peony anthracnose）、玉米大斑病病菌（Setosphaeria turcica）、油菜菌核病病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；均保存于 4 ℃备用。

1.5 菌株发酵和代谢产物的提取分离

试验菌株经过活化后，采用大米培养基进行固体发酵，于28 ℃静置培养30 d。将发酵物阴干粉碎后分别用乙酸乙酯、甲醇溶液提取，提取液经减压浓缩后得到460 g浸膏。采用硅胶柱色谱对浸膏进行分离，以石油醚、乙酸乙酯、甲醇为溶剂进行梯度洗脱，得到4个组分。组分2（96.93 g）经过多次硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱分离，再经过重结晶纯化，依次得到30 mg化合物1、63 mg化合物2。组分3（133.83 g）经过多次硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱分离，再经过重结晶纯化，依次得到53 mg化合物3、136 mg化合物4、161 mg化合物5。endprint

1.6 代谢产物的结构鉴定

对所得化合物的形状、颜色等理化性质进行观察，并测量其熔点，再采用核磁共振（1H-NMR、13C-NMR等）对所得化合物的结构进行解析，最后与相关参考文献进行对照，确定所得化合物的结构。

1.7 抑菌活性测试

对所得化合物进行抑菌活性测试，它们对微生物生长的抑制作用可通过最小抑菌浓度来判断，具体操作[12]如下：（1）将斜面培养基上已活化的测试菌用无菌水冲洗下来，再用牛肉膏蛋白胨液体培养基（细菌）、马铃薯葡萄糖液体培养基（真菌）将其配制成浓度为106 CFU/mL的菌悬液；（2）用二甲基亚砜将待测化合物溶解，使其浓度为 1 mg/mL；（3）在96孔板的第1孔至第12孔中均加入100 μL液体培养基，再向第1孔中加入100 μL待测化合物溶液，利用二倍稀释法连续稀释至第10孔，第11、第12孔分别留作液体培养基和二甲基亚砜的空白对照；（4）向上述96孔板中的每个孔中均加入 100 μL 测试菌菌悬液。重复上述试验操作，每组进行3次平行试验。以青霉素钠作为革兰氏阳性菌的阳性对照，硫酸链霉素作为革兰氏阴性菌的阳性对照，多菌灵作为植物病原真菌的阳性对照。将细菌试验组的96孔板在37 ℃下恒温培养24 h、植物病原真菌试验组的96孔板在28 ℃下恒温培养 48 h 后观察并记录试验结果。

1.8 抗氧化活性测试

对所得化合物进行清除DPPH自由基的抗氧化活性測试，具体操作[13]如下：（1）将待测化合物溶解于甲醇溶液中，使其浓度为2 mg/mL；（2）在酶标板的第1、第2排的每个孔中均加入100 μL甲醇溶液，再向每排的第1孔中均加入 100 μL 待测化合物溶液，利用二倍稀释法连续稀释至第11孔，第12孔留作甲醇的空白对照；（3）向第1排的每个孔中均加入100 μL新配制的含0.2 mg/mL DPPH·的甲醇溶液，向第2排的每个孔中均加入100 μL甲醇。选用维生素C作为阳性对照，进行3次平行试验。将上述酶标板于室温下遮光放置30 min后，在波长为517 nm的酶标仪中测定每个孔的吸光度。

抗氧化性能可以根据待测化合物对DPPH自由基的清除率来判断，其计算公式如下：

式中：E为DPPH自由基清除率；D0为DPPH·溶液和甲醇溶液（第1排第12孔）的吸光度；D1为待测化合物溶液、DPPH·溶液和甲醇溶液（第1排前11个孔）的吸光度；D2为待测化合物溶液和甲醇溶液（第2排前11个孔）的吸光度。

根据公式（1）计算出不同浓度下化合物的自由基清除率。以化合物浓度为横坐标（x），自由基清除率为纵坐标（y），绘制自由基清除率曲线图，并对其进行线性拟合。按照拟合方程计算出当y=50时x的值，此时x的值就是化合物的半抑制浓度IC50。

2 结果与分析

2.1 代谢产物的结构鉴定

从试验菌株的发酵物中分离得到5个生物碱类化合物，分别为次黄嘌呤（1）、腺嘌呤（2）、尿囊素（3）、胸腺嘧啶脱氧核苷（4）、尿嘧啶核苷（5），其化学结构如图1所示。

化合物1，米黄色粉末，熔点> 350 ℃。1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亚砜）δ：13.36[单峰（s），1H，7-H]，12.25（s，1H，1-H），8.13（s，1H，2-H），7.99（s，1H，8-H）。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亚砜）δ：155.34（6-C），153.15（4-C），144.65（2-C），140.16（8-C），119.07（5-C）。化合物 1 的核磁共振试验数据与文献[14]报道的数据基本一致，因此确定化合物1为次黄嘌呤（hypoxanthine）。

化合物2，米黄色粉末，熔点> 350 ℃。1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亚砜）δ：12.84（s，1H，7-H），8.11（s，1H，2-H），8.10（s，1H，8-H），7.09（s，1H，6-NH2）。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亚砜）δ：155.14（6-C），152.39（2-C），150.91（4-C），139.53（8-C），117.35（5-C）。化合物 2 的核磁共振试验数据与文献[15]报道的数据基本一致，因此确定化合物2为腺嘌呤（adenine）。

化合物3，淡黄色粉末，熔点239～240 ℃。1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亚砜）δ：10.55（s，1H，1-H），8.07（s，1H，3-H），6.90[d，耦合常数（J） = 8.2 Hz，1H，6-H]，581（s，2H，8-H），5.25[双二重峰（dd），J=8.2，1.0 Hz，1H，4-H]。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亚砜）δ：173.57（5-C），15730（7-C），156.72（2-C），62.36（4-C）。化合物 3 的核磁共振试验数据与文献[16]报道的数据基本一致，因此确定化合物3为尿囊素（allantoin）。

化合物4，白色粉末，熔点为185 ～ 187 ℃。 1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亚砜）δ：11.28（s，1H，3-H），7.71[双峰（d），J=1.0 Hz，1H，6-H]，6.17[三重峰（t），J=6.9 Hz，1H，1′-H]，5.26（d），J=4.1 Hz，1H，3′-OH），5.06（t，J=5.1 Hz，1H，5′-OH），4.25[多重峰（m），1H，3′-H]，3.76（dd，J=6.6，3.6 Hz，1H，4′-H），3.57（m，2H，5′-H），2.07（m，2H，2′-H），1.77（s，3H，5-CH3）。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亚砜）δ：163.72（4-C），150.43（2-C），136.10（6-C），109.32（5-C），8721（1′-C），83.69（4′-C），7039（3′-C），61.28（5′-C），39.36（2′-C），12.22（5-CH3）。化合物 4 的核磁共振试验数据与文献[17]报道的数据基本一致，因此确定化合物4为胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine）。endprint

化合物5，白色粉末，熔点为164 ～ 165 ℃。1H-NMR（400 MHz，氘代二甲亚砜）δ：11.32（s，1H，3-H），7.89（d，J=8.1 Hz，1H，6-H），5.78（d，J=5.4 Hz，1H，1′-H），565（d，J=8.2 Hz，1H，5-H），5.40（d，J=4.6 Hz，1H，2′-OH），5.12（s，2H，3′，5′-OH），4.02（d，J=4.5 Hz，1H，2′-H），397（d，J=4.6 Hz，1H，3′-H），3.84（dd，J=6.7，3.2 Hz，1H，4′-H），3.59（m，2H，5′-H）。13C-NMR（100 MHz，氘代二甲亚砜）δ：163.10（4-C），150.72（2-C），140.70（6-C），101.71（5-C），87.62（1′-C），84.79（4′-C），73.50（3′-C），69.84（2′-C），60.80（5′-C）。化合物 5 的核磁共振试验数据与文献[18]报道的数据基本一致，因此确定化合物5为尿嘧啶核苷（uridine）。

2.2 抑菌活性的测试结果

以4株细菌和10株植物病原真菌作为测试菌，分别选用青霉素钠、硫酸链霉素、多菌灵作为阳性对照，对所得化合物进行抑菌活性测试。由表1可知，化合物 3（尿囊素）对这4株细菌和10株植物病原真菌均有一定的抑制作用；化合物 1（次黄嘌呤）、化合物 2（腺嘌呤）分别对辣椒疫霉病病菌、烟草赤星病病菌具有一定的选择性抑制作用。

2.3 抗氧化活性測试结果

对所得化合物进行清除DPPH自由基的抗氧化活性测试，其拟合方程和IC50值如表2所示，与对照维生素C的测试结果相比，化合物1～化合物5均没有较强的抗 氧化活性，但化合物 2（腺嘌呤）和化合物 3（尿囊素）具有一定的抗氧化活性。

3 结论与展望

对1株分离自夹竹桃茎部的链格孢属内生真菌的代谢产物进行研究，从中分离得到5个生物碱类化合物，分别为次黄嘌呤（1）、腺嘌呤（2）、尿囊素（3）、胸腺嘧啶脱氧核苷（4）、尿嘧啶核苷（5）。其中，化合物1、3、4、5 为首次从链格孢属真菌的发酵物中分离得到。化合物3（尿囊素）具有一定的抑菌活性和抗氧化活性，化合物2（腺嘌呤）具有一定的抗氧化活性。因此，该菌株具有一定的开发利用价值。因此，可以对分离自夹竹桃植物中的其他内生真菌的代谢产物进行研究，以丰富国内外对夹竹桃内生真菌代谢产物的研究报道，从而进一步开发和利用夹竹桃内生真菌。

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