林丽+陈泽斌+何群香+徐松萍+华金珠+黄丽+徐胜光

摘要： 为了揭示烟草不同器官中内生细菌的分布规律，应用Illumina测序平台的MiSeq高通量测序仪对烟草根、茎、叶中内生细菌的16S rDNA-V4区扩增子进行测序，对测得数据进行生物信息学分析，评价物种α多样性和β多样性。经FLASH软件对序列进行拼接，茎、叶、根样品分别获得36 129、60 312、52 573条原始序列，经Qiime软件过滤，再剔除宿主的叶绿体和线粒体序列，最终分别得到35 190、58 938、51 268条有效序列，在97%的序列相似性水平上，这些有效序列被Uparse软件划分为1 447、1 141、1 220个操作分类单元（OTUs）。序列比对结果表明，在根、茎、叶中芽球菌属（Blastococcus）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）为优势菌。类诺卡氏菌属（Nocardioides）、链霉菌属（Streptomyces）、Gemmatimonadaceae属、Gaiella属、壤红杆菌属（Solirubrobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）细菌表现出组织专一性，主成分分析表明，根和叶中内生细菌群落结构最为相似。烟草植株内蕴含丰富的细菌资源，受组织结构及成分因素影响表现出器官差异性，即茎>根>叶。通过对烟草不同部位内生细菌多样性进行研究，可为烟草植物生物活性内生菌株的发掘利用提供理论依据。

关键词： 烟草；营养器官；内生细菌；组成；多样性；分布规律；生物信息学；宿主；优势菌；基因工程菌

中图分类号： S572.01；Q939.92 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0274-05

植物内生细菌（endophytic baeteria）泛指那些在其生活中的一定阶段或全部阶段生活于健康植物体内对植物器官未引起明显病害症状的微生物[1]。近年来，已知在地球上接近30种的高等植物中每个物种都与多种内生细菌共生[2]。对烟草植物中内生细菌的报道早就出现了，但大多采用一代测序进行研究分析，运用二代测序进行研究分析的报道少之又少。因此，本研究采用Illumina高通量测序平台的MiSeq测序仪对烟草不同部位内生细菌的16S rDNA扩增子进行二代测序，相较于传统的组织培养法以及基于一代测序的非培养方法，测序费用低，测序深度更大，检测灵敏度更高，从而能更好地实现对烟草不同部位内生细菌种类的准确调查，从而加深对烟草内生细菌种群结构的了解。

内生细菌是一个多样性丰富的微生物类群，生活于健康植物的各个组织和细胞间隙内，具有稳定的生存空间，不易受环境条件的影响，可以在植物体内独立地分裂繁殖和传递，并与宿主植物协同进化[3]。内生细菌长期生活在植物组织内，与宿主形成共生關系，生态适应性强，产生活性物质，并参与信息转导作用直接作用于宿主本身，植物内生细菌能够促进宿主植物的生长、提高宿主植物的抗病虫害能力、增强宿主植物抗逆性[4]，提高宿主植物对环境的适应性，加强系统的生态平衡。研究表明，高等植物中普遍存在内生细菌，据不完全文献统计，截至2010年，在各种农作物及经济作物中发现的内生细菌已超过129种，分属于54个属，主要为假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、泛菌属（Pantoea）、甲基杆菌属（Methylobacterium）等[5]。陈泽斌等采用研磨组织稀释分离法分离烟草植株中的内生细菌，对不同组织器官、不同生长期的烟草内生细菌菌群密度进行研究。结果表明，烟株的根、茎、叶中均存在大量的内生细菌，烟草内生细菌的分布存在品种差异、生长期差异、组织部位差异。在整个生育期中，以成熟期内生细菌的数量最多[6]。他们还采用稀释平板法从健康烟草的根、茎、叶组织中分离到267株内生细菌，并利用细菌菌落表征性状和16S rRNA序列对这些分离物进行多样性分析。经克隆测序分析表明，这267株分离物分别与GenBank中6类细菌中的21个已知种相似性达到98%～99%[7]。王茂胜等为揭示烟草内生细菌多样性，选择K326、云85和红花大金元3个烤烟品种进行内生细菌的分离和16S rDNA序列分析鉴定，获得不同品种烟草内生细菌的多样性特征。结果显示，3个品种的香农指数以K326最高，为2.02；其次是云烟85，为1.48；红花大金元最低，为1.30[8]。这些研究进展所采用的都是一代测序技术，然而早期一代测序技术普遍存在诸如文库构建过程复杂、测序成本较高、通量低、难以做大量的平行测序等缺点。为了克服上述缺点，笔者利用近年来发展的新二代测序技术，不仅在文库构建等方面取得了重要突破，进一步简化了测序操作，降低了测序成本，缩短了测序时间；而且二代测序技术的出现使DNA测序的通量有所提高，原来只有在大型测序中心才能完成的测序任务现在已经可以在更多的实验室展开。本研究采用近年来兴起的Illumina MiSeq二代测序技术对烟草根、茎、叶内生细菌种类组成进行分析，相较于传统的纯培养方法及以16S rDNA为基础的非培养方法，能够产生测序覆盖深度更大的数据量，从而对烟草内生细菌的种类进行全面而准确的调查，为丰富植物微生态学理论及基因工程菌的研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2016年7月27日于云南省宣威市落水镇试验田随机选取10株成熟期健康无明显病害烟草，烟草品种为云烟87，采集其根、茎、叶放入无菌样品袋中，均匀混合，低温保鲜，24 h内进行表面消毒处理。

1.2 表面消毒

将烤烟根、茎、叶用灭菌水冲洗干净，先用1%次氯酸钠浸泡5 min，再用75%乙醇浸泡2 min，无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分，表面消毒效果接近100%[9]。

1.3 总DNA提取

按参考文献[10]所采用的CTAB方法提取根、茎、叶的总DNA，并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检查DNA的完整度和浓度，并将剩余的样品存于2 mL离心管中，使用无菌水稀释样品DNA至1 ng/μL。endprint