古丽巴哈尔?卡吾力+高晓黎+常占瑛+古丽格娜?吐尔地+王玲+谢湘云

摘要： 应用水提法提取黑果枸杞中总黄酮，采用单因素和Box-Behnken试验设计，利用响应面分析法选取乙醇体积分数、提取时间、提取温度以及料液比进行4因素3水平试验，优化黑果枸杞总黄酮的提取工艺，并测定总黄酮清除超氧阴离子、DPPH和羟自由基的能力，初步考察其抗氧化活性。结果表明：水浴提取的最优工艺参数为乙醇的体积分数为79.6%，提取时间为60.8 min，料液比为1 g ∶ 15.6 mL，提取温度为70.2 ℃。在此优化条件下，黑果枸杞总黄酮的提取量可达到69.02 μg/mL。其中影响提取工艺参数的主次因素为料液比>乙醇体积分数>提取温度>提取时间。总黄酮对超氧阴离子、DPPH和羟自由基清除能力可以达到59.32%、72.68%、46.14%，说明黑果枸杞总黄酮具有一定的抗氧化活性。

关键词： 黑果枸杞；总黄酮；响应面；抗氧化活性

中图分类号： R284.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0213-05

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）为茄科枸杞属的一个物种，具棘刺，浆果球形，皮薄，皮熟后紫黑色，果实含丰富的紫红色素，极易溶于水，属天然的水溶性花色苷黄酮类。主要出产于甘肃酒泉、新疆、内蒙、青海等沙漠地带，海拔高、气候干旱，生态环境洁净、无污染。传统医学关于黑枸杞的功效论述为，黑枸杞能滋补肝肾、益精明目、适用于腰膝酸软、头晕目眩、两眼昏花等症状，藏医药经典《四部医典》《晶珠本草》等记载黑果枸杞主治心热病、心脏病、月经不调、停经等。《维吾尔药志》记载维吾尔医生常用黑果枸杞果实及根皮治疗尿道结石、癣疥、齿龈出血等症，民间作滋补强壮以及降压药。现代科学研究证实了上述说法，并且认为黑果枸杞可以降低胆固醇，兴奋大脑神经，增强免疫功能，防治癌症，抗氧化、抗衰老和美容，黑果枸杞提取物可促進细胞免疫功能，增强淋巴细胞增殖及肿瘤坏死因子的生成，对白细胞介素Ⅱ有双向调节作用，能缓解糖尿病患者多饮多食、体重减轻症[1-4]。

黄酮类化合物是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其他包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。人们发现黄酮类化合物有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用。到20世纪70年代，又发现它们有抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等作用[5-8]。为此，本试验采用单因素和Box-Behnken试验优化黑果枸杞总黄酮的提取工艺参数，并对总黄酮抗氧化活性进行检测，以期能为黑果枸杞开发利用提供依据[9-13]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞采自新疆维吾尔自治区阿克苏市塔里木盆地。

芸香苷标准品，成都曼斯特生物科技有限公司（UV级，纯度为98.6%）；无水乙醇、盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、纯化水、氢氧化钠、DPPH（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl），Sigma-ALDRICH公司；无水乙醇、纯水、氢氧化钠、盐酸、铁氰化钾、三氯乙酸、磷酸盐缓冲液、水杨酸、双氧水、硫酸亚铁、抗坏血酸（维生素C）、硫酸铜、邻苯三酚均为分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计UV-9100型，北京莱伯泰科仪器有限公司；扣压式小型粉碎机XL-02A型，旭朗机械；电热恒温水浴锅HWS24型，上海恒科学仪器有限公司；循环真空泵SHZ型，河南省郑州博科仪器设备有限公司；电子天平XPE型，梅特勒-托利多；扣压式小型粉碎机XL-02A型，旭朗机械。

1.3 方法

1.3.1 黑果枸杞总黄酮含量测定方法学考察

1.3.1.1 标准曲线的绘制

芸香苷标准品10 mg，用60%乙醇溶解并定容至10 mL，摇匀得质量浓度为1 mg/mL的芸香苷标准溶液。准确吸取上述标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 置于25 mL的容量瓶中各加水至10 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，溶液摇匀放置5 min，加10%硝酸铝溶液10 mL，摇匀放置5 min，加4%氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，摇匀放置15 min，以相应的试剂溶液为空白，在500 nm处测定吸光度。以芸香苷质量浓度（C，mg/mL）为横坐标，吸光度（D）为纵坐标绘制标准曲线，其回归方程和相关系数为：C=9.493D+0.044，r2=0.998，标准曲线具有良好的拟合性。

1.3.1.2 精密度试验

准确吸取0.05、0.15、0.25 mg/mL 3种浓度芸香苷标准溶液各1.0 mL，按照“1.3.1”节方法连续测定5次，分别计算总黄酮吸光度的RSD，其结果分别为 1.02%、113%、0.98%。

1.3.1.3 稳定性试验

准确吸取0.05、0.15、0.25 mg/mL 3种浓度芸香苷标准溶液各1.0 mL，按照“1.3.1”节方法分别在0、2、4、6、8、10 h测定，分别计算总黄酮吸光度的RSD，其结果分别为1.32%、2.08%、1.46%。

1.3.1.4 加标回收率考察

准确吸取9份已知总黄酮浓度的供试品各1.0 mL，分别加入0.05、0.15、0.25 mg/mL 3种浓度的芸香苷标准品溶液各1.0 mL，按照“1.3.1”节方法进行测定，其平均回收率为98.31%、99.01%、99.72%。

1.3.2 黑果枸杞总黄酮提取及含量测定

将采集的黑果枸杞清洗后在阴凉处干燥至恒质量，用粉碎机粉碎并过60目筛，索氏提取器用石油醚脱脂3.0 h，干燥后备用[14-18]。准确称取脱脂后黑果枸杞粉0.5 g，用不同体积分数乙醇、不同提取温度、不同提取时间和不同料液比进行水浴提取并离心。离心后的提取液减压浓缩，采用真空干燥箱干燥，再将干品用蒸馏水溶解，按照标准品含量测定的操作测定黑果枸杞总黄酮的提取量。endprint

1.3.3 单因素试验

根据黑果枸杞总黄酮提取方法，准确称取0.5 g黑果枸杞粉末，考察乙醇体积分数（60%、70%、80%、90%、100%）、提取时间（40、50、60、70、80 min）、料液比[1 ∶ 5、1 ∶ 7.5、1 ∶ 10、1 ∶ 12.5、1 ∶ 15（g/mL）]、提取温度（50、60、70、80、90 ℃）对黑果枸杞总黄酮提取量的影响。

1.3.4 提取工艺响应面优化试验

在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计，以黑果枸杞总黄酮提取率为响应值，乙醇体积分数、提取时间、提取温度、料液比为考察因素，利用响应面4因素3水平试验对黑果枸杞总黄酮提取工艺参数进行优化。采用Design Expert 8.0.6软件对数据进行分析。试验因素和水平表见表1。

1.3.5 黑果枸杞总黄酮抗氧化活性测定

1.3.5.1 黑果枸杞总黄酮超氧阴离子清除能力

按照王建等的方法[19]配制总黄酮1.380、1.726、2.300、3.451、6.902 μg/mL 提取溶液，分别准确吸取2.0 mL，恒温25 ℃下将pH值为8.2的Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L）3.0 mL与邻苯三酚（50 mmol/L）10 μL迅速混合后，325 nm处测定吸光度，每隔30 s测定1次，持续5.0 min结束，以D为横坐标，时间为纵坐标进行回归，其斜率为邻苯三酚自氧化速率为D0。样品组将pH值8.2的Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L）3.0 mL加0.5 mL提取液用同样方法测定，其斜率为Ds，按照下式进行计算：

1.3.5.2 黑果枸杞总黄酮DPPH清除能力

按照Sone等的方法[20]配制總黄酮1.380、1.726、2.300、3.451、6.902 μg/mL 提取溶液，分别准确吸取2.0 mL，加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液混匀，避光放置30 min，517 nm处测定Dt。同法取2 mL蒸馏水加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液测定吸光度记为D0。取2.0 mL提取液加入2 mL乙醇混匀测定吸光度为Db，按照一下公式计算DPPH自由基清除能力：

1.3.5.3 黑果枸杞总黄酮羟自由基清除能力

按照Milaevae等的方法[21]配制总黄酮1.380、1.726、2.300、3451、6.902 μg/mL提取溶液，分别准确吸取2.0 mL，加入 9 mmol/L FeSO4 0.5 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液 2.0 mL、8.8 mmol/L的H2O2启动反应，在37 ℃水浴0.5 h，以蒸馏水为对照，在510 nm处测定吸光值，记为Ds。对照组加入2.0 mL蒸馏水代替提取液，其余操作同上测定吸光值，记为D0，按照以下公式计算羟自由基清除能力，即：

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对黑果枸杞总黄酮提取量的影响

变动乙醇体积分数，在提取温度70 ℃，料液比1 g ∶ 10 mL条件下提取60 min并计算其提取量。乙醇体积分数对黑果枸杞总黄酮提取量的影响见图1。

由图1可知，随着乙醇体积分数的提高，黑果枸杞总黄酮提取量明显增加；当乙醇体积分数提高到80%时，黑果枸杞总黄酮提取量最高，再提高体积分数提取量反而降低。结果表明，提高乙醇体积分数能增加黑果枸杞中总黄酮向溶剂方向扩散，但是再提高乙醇的体积分数溶出总黄酮的同时，有一些醇溶性杂质，脂溶性成分溶出量增加，使溶液黏度变大，增大了传质过程中溶剂的阻力，减慢了黑果枸杞总黄酮向溶剂扩散，减少了粉末表面与溶剂之间黑果枸杞总黄酮浓度差，从而导致黑果枸杞总黄酮的提取量减少。

2.1.2 提取时间对黑果枸杞总黄酮提取量的影响

改动提取时间，以80%乙醇，在提取温度70 ℃、料液比1 g ∶ 10 mL条件下提取并计算其提取量。提取时间对黑果枸杞总黄酮提取量的影响见图2。由图2可知，随着提取时间的延长，黑果枸杞总黄酮的提取量增加，但提取时间为80 min时，提取率开始下降。结果表明，延长提取时间，黑果枸杞总黄酮不断溶出，进入溶液，可以提高黑果枸杞总黄酮提取量。但提取一定时间以后总黄酮已基本溶出，继续增加提取时间，总黄酮提取量反而下降。表明时间过长对总黄酮的提取量无明显影响，且延长提取时间还会增加耗能，并考虑后期的工业化生产，提取时间在 80 min 左右为宜。

2.1.3 料液比对黑果枸杞总黄酮提取量的影响

改动料液比，以80%乙醇，在70 ℃提取60 min条件下计算其提取量。料液比对黑果枸杞总黄酮提取量的影响见图3。由图3可知，随着料液比的增加，黑果枸杞总黄酮的提取量虽增加，但到1 g ∶ 7.5 mL时提取量开始下降。结果表明，料液比较低时，溶液很容易达到饱和，总黄酮未能充分溶出，提取量较低。当料液比继续增加时，虽然固体粉末与溶剂接触面增加，但是黑果枸杞总黄酮量在大体积溶剂中的被稀释，提取量反而增加，且在工业生产时可以节省部分材料。

2.1.4 提取温度对黑果枸杞总黄酮提取量的影响

改动提取温度，以80%乙醇，在料液比1 g ∶ 10 mL提取60 min条件下并计算其提取量。提取温度对黑果枸杞总黄酮提取量的影响见图4。由图4可知，随着提取温度的提高，黑果枸杞总黄酮的提取量增加，到提取温度为70 ℃时，提取量达到顶点，以后随着温度提高黑果枸杞总黄酮提取量开始下降。结果表明，提高提取温度，增加黑果枸杞总黄酮在溶剂中的溶解度，到70 ℃左右达到最高提取量，但是温度过高可能导致总黄酮的结构被破坏，而且温度过高会导致黑果枸杞总黄酮的生物活性降低。endprint

2.2 响应面优化黑果枸杞总黄酮提取工艺

2.2.1 响应面试验结果

在单因素试验结果的基础上，采用Box-Behnken试验设计，以乙醇体积分数（A）、提取时间（B）、料液比（C）、提取温度（D）为试验的4个因素，并以总黄酮的提取量为考察指标，设计4个因素3个水平的响应面设计。因素水平及编码见表1，试验设计方案及结果见表2。

2.2.2 Box-behnken试验结果

采用Design-Expert 8.0.6软件对黑果枸杞总黄酮提取量进行多元模型拟合分析，得到黑果枸杞总黄酮提取量与乙醇体积分数、提取时间、料液比和提取温度的多项二次回归方程：

Y=60.19-3.61A-1.59B-5.83C+2.19D-1.60AB-4.89AC+1.06AD-6.57BC-0.93BD+3.87CD-10.46A2-6.52B2-3.33C2-4.82D2。

应用软件Design-Expert 8.0.6对试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3结果显示，响应面模型F值为9.09，P<0.000 1回归模型极显著，失拟性为0.062 6，P>0.05不显著，说明此模型与实际情况拟合很好。R2=0.900 6，RAdj2=0.801 2，Rp2=0457 2，说明预测值和实测值之间具有高度的相关性，模型方程能够很好地反映真实的试验值。由表3可知，该模型中一次项A、C、D对该模型的影响达到显著（P<0.05）。二次项中A2、B2、D2对模型的影响极显著（P<0.01），C2对模型的影响显著（P<0.05），且模型中AC（乙醇体积分数和料液比）和BC（提取时间和料液比）之间具有交互相应（P>005），彼此之间有影响。影响黑果枸杞总黄酮提取量的因素顺序为：料液比（C）>乙醇體积分数（A）>提取温度（D）>提取时间（B）。

2.2.3 响应面优化分析

响应面图可以直观地反映交互作用[CM（25]的显著程度，根据回归方程绘制响应面图（图5）。由图

5-A可知，提取时间较短时，提高乙醇体积分数黑果枸杞总黄酮提取量有所提高，但相关性较差。 由图5-B可知， 料液比较低时，提高乙醇体积分数黑果枸杞总黄酮提取量明显升高。增加料液比总黄酮提取量明显减少，说明乙醇体积分数和料液比相关性较强。由图5-C可知，提取温度和乙醇体积分数两者同时提高时，黑果枸杞总黄酮提取量有所增加，但是差异不明显，乙醇体积分数和提取温度相关性比较弱，无交互作用。由图5-D可知，在较低料液比时，延长提取时间，黑果枸杞总黄酮提取量有明显的上升趋势，彼此之间相关性强，有交互作用。由图5-E可知，提取温度和提取时间同时增加，提取量有部分上升趋势，但是不明显，响应面图比较平滑，相关性较差。由图5-F可知，料液比和提取温度相关性较强，响应面图较陡峭，随着提取温度的提高，在较低的料液比条件下，黑果枸杞总黄酮提取量明显增加，呈负相关关系。因此，为了进一步探究各因素之间的交互作用，对Box-behnken试验结果进行了响应面分析（表2）。根据建立的回归模型得出黑果枸杞总黄酮的提取工艺参数分别为乙醇体积分数79.6%、提取时间为 60.8 min、料液比为1 g ∶ 15.mL、提取温度为70.2 ℃。按照优化的条件进行验证试验（n=3），其提取量可以达到 69.02 μg/mL， 说明优化工艺条件参数具

有一定的实际价值。

2.3 黑果枸杞总黄酮抗氧化活性

由图6可知，随着黑果枸杞总黄酮质量浓度的增加，其总黄酮对超氧阴离子、DPPH、羟自由基清除能力逐渐提高，分别可以达到59.32%、72.68%、46.14%。说明黑果枸杞总黄酮能清除体内多余的自由基，清除率与总黄酮浓度有一定的量效关系，说明黄酮有抗氧化活性。

3 结论

响应面分析结果表明，提取黑果枸杞总黄酮的最佳组合为：乙醇体积分数80%、提取时间60 min、料液比 1 g ∶ 15 mL、提取温度70 ℃。各因素对总黄酮提取量的影响程度为料液比（C）>乙醇体积分数（A）>提取温度（D）>提取时间（B）。在此条件下实测黑果枸杞总黄酮的提取量为 69.02 μg/mL，与理论值相差0.120 1 μg/mL。回归模型和响应面分析结果表明，该提取方法合理、可行、稳定。在此基础上对黑果枸杞总黄酮对超氧阴离子、DPPH、羟自由基的清除能力进行检测，结果说明，黑果枸杞总黄酮有较强的抗氧化活性。上述结果为今后黑果枸杞总黄酮提取工艺的放大研究、总黄酮的分离纯化及结构解析、功能机理研究等具有一定的参考价值[22-25]。

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