邢玉娟+王建国+陈玉库+胡元亮+王德云+蔡丙严

摘要： 将14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡594羽随机均分为11组，1～9组分别为OM-APS、OM和APS的高、中、低剂量组，10组为免疫对照组，11组为空白对照组。除空白对照组外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、点眼免疫，28日龄重复免疫。在首次免疫的同时，1～9组分别口服高、中、低剂量药物，疫苗对照组和空白对照组口服等量生理盐水，每天1次，连续3 d。分别于14、21、28、35、42日龄采血，用MTT法测定T淋巴细胞增殖的变化，用β-微量法测定血清抗体效价变化。于14、21、28、35日龄，每组随机抽取4羽，称体质量，剖杀，摘取法氏囊和脾脏并称体质量，计算免疫器官指数。于69日龄用新城疫强毒攻毒，观察保护率。结果表明，OM-APS、OM、APS的高、中浓度在各时间点均能促进T淋巴细胞增殖；OM-APS高、中浓度在各时间点抗体效价明显高于免疫对照组；OM-APS的高、中、低浓度在各时间点的脾指数、高、中浓度各时间点的法氏囊指数均明显高于免疫对照组；OM-APS、APS的高、中、低浓度，OM中、低浓度的攻毒保护率均高于或明显高于免疫对照组。

关键词： 中药成分复方；T淋巴细胞增殖；新城疫疫苗；免疫应答；抗体效价；免疫器官指数；攻毒保护率

中图分类号： S853.74 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0182-05

研究证明，中药作为一种免疫增强剂，具有来源广泛、效果显著、无毒副作用等优势，不仅能克服油乳类、铝胶类化学佐剂副作用大、局部刺激重、致癌、制备和使用麻烦或不能足提高弱抗原的免疫原性等弊病 ，而且能显著增强机体的细胞免疫和体液免疫功能，促进免疫器官的发育和细胞因子的分泌[3-4]。

在以前的研究中，笔者首先通过体外试验筛选出OM、APS等中药成分，这些成分具有显著抑制NDV病毒增殖的作用，然后比较了中药成分复方体外抗NDV感染的效果。结果表明，中药成分复方高、中、低浓度能显著抑制NDV感染CEF[5]。并通过临床试验比较了中药成分复方对雏鸡人工感染新城疫的疗效，结果表明，中药成分复方在攻毒前、攻毒时和攻毒后3种给药方式，均能显著降低受试鸡的死亡率，提高血清NDV抗体效价，减轻死亡鸡的器官出血[6]。

本试验在测定了4种中药成分及其4个复方对鸡脾脏淋巴细胞增殖影响的基础上，进一步测定了中药成分复方及其组分药配合新城疫疫苗免疫后雏鸡外周血T淋巴细胞增殖的变化，血清抗体效价的变化，对法氏囊指数、脾指数以及对攻毒保护率的影响，通过各中药组和免疫对照组、空白对照组差异比较的观察，进一步探讨中药成分复方免疫增强的作用机理，为研制中药成分免疫增强剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物准备

根据以前的试验结果[5-6]，分别用双蒸水将OM、APS和OM-APS（OAP）稀释成高（4 mg/mL）、中（2 mg/mL）、低（1 mg/mL）3种浓度，常规消毒后备用。

1.2 疫苗和病毒

新城疫Ⅳ系（newcastle disease virus Ⅳ strain，NDV-Ⅳ）疫苗，中牧股份南京药械厂生产，批号753-3。新城疫检测抗原，由南京农业大学动物医学院中兽医研究室提供。新城疫强毒（newcastle disease virus，NDV）E01株，由江苏省农业科学院兽医研究所禽病研究室提供。将病毒按常规方法接种9日龄SPF鸡胚，恒温培养72 h，收获尿囊液，按Reed-Muench法[7]测定EID50为10-8.83。

1.3 主要试剂

RPMI1640培養液，Gibco公司产品，按说明书用三蒸水配制后过滤除菌，分装，4 ℃保存，临用前加入犊牛血清达5%和青霉素、链霉素各100 IU/mL；植物血凝素（PHA），上海伊华科技有限公司产品，用RPMI1640培养液配制成 0.1 mg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后-20 ℃保存；四甲基偶氮唑蓝（MTT）溶液，Amresco公司产品，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，使终浓度为5.0 mg/mL，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装后4 ℃冰箱避光保存；淋巴细胞分离液，上海恒信化学试剂有限公司产品；淋巴细胞裂解液，二甲亚砜（DMSO），分析纯，苏州正兴化工研究院产品。

1.4 试验动物

1日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡594羽，购自汤泉农垦种鸡场。试验期间采用笼养，全价饲料，自由采食和饮水，1～14日龄采用红外灯保温，全日制光照。

1.5 试验设计

雏鸡饲养至14日龄（平均体质量95 g，平均母源抗体效价3.3log2时，随机均分为11组（每组54羽）。1～9组为OAP高剂量组（OAPH）、OAP中剂量组（OAPM）、OAP低剂量组（OAPL）、OM高剂量组（OMH）、OM中剂量组（OMM）、OM低剂量组（OML）、APS高剂量组（APSH）、APS中剂量组（APSM）和APS低剂量组（APSL），10组为疫苗对照组，11组为空白对照组。除空白对照组外均用NDV-Ⅳ系疫苗滴鼻、点眼免疫，每羽4羽份。28日龄重复免疫。在首次免疫的同时，3个中药复方组分别口服高、中、低剂量的OAP复方，每羽1.0 mL，6个单味药对照组分别口服高、中、低剂量的OM和APS，每羽1.0 mL，免疫对照组和空白对照组口服等量生理盐水，每天1次，连续3 d。分别于14、21、28、35、42日龄，每组随机抽取4羽，无菌心脏采血（每羽4.0 mL），肝素抗凝，测定外周血淋巴细胞增殖；每组随机抽取10羽翼静脉采血，分离血清，用β-微量法测定HI抗体效价；在14、21、28、35日龄，每组随机抽取4羽，称质量，剖杀，摘取法氏囊和脾脏并称质量，计算免疫器官指数（免疫器官质量/体质量×100%）；于69日龄用新城疫强毒攻毒，观察保护率。endprint

1.6 淋巴细胞增殖测定方法

采用MTT法[3-4，8]。将抗凝血样（每羽4.0 mL）用Hanks液稀释1倍，小心加在淋巴细胞分离液上层，2 000 r/min离心20 min，吸取中间云雾状白细胞层，用无血清RPMI1640营养液洗2遍，1 500 r/min离心15 min。台盼蓝染色，细胞计数活细胞大于90%后，用RPMI1640营养液调整细胞浓度为 2.5×106个/mL，加入到96孔细胞培养板（德国Nunclon公司生产）中，80 μL/孔，再加20 μL/孔 PHA，每个样品重复4孔，然后置于39.5 ℃、5% CO2条件下（CO2培养箱，美国Revco公司产品）培养44 h，取出，加入MTT溶液20 μL/孔，继续培养4 h，加裂解液100 μL/孔，将细胞板置于微量振荡器（75-2A型，上海医用分析仪器厂生产）上振荡 5 min 使沉淀完全溶解，在酶联免疫仪（DG-3022型，中国华东电子管厂生产）上检测570 nm处的吸光度（D570 nm）作为T淋巴细胞增殖的指标。

1.7 抗体效价测定方法

在96孔微量血凝板上，从左到右各加50 μL/孔 PBS液，再向每排的第1孔加入50 μL待检血清，依次向后倍比稀释直至第12孔，然后向每孔加入50 μL 4个单位抗原，在微量振荡器上振荡混匀后置于温箱中感作20 min；取出，加入50 μL/孔鸡红细胞悬液，同时设阳性血清、阴性血清及空白对照孔。振荡混匀后置于37 ℃温箱中感作30 min，待对照孔红细胞已经沉淀时观察结果[7]。

1.8 攻毒保护率测定方法

除空白对照组外，根据预试验结果，将新城疫病毒E01株稀释100倍，肌肉注射0.5 mL/羽。每天记录各组死亡数，死亡鸡剖检，至攻毒后8 d停止死亡时计算死亡率和攻毒保护率。

1.9 数据处理

淋巴细胞D570 nm值、HI效价和免疫器官指数以“平均值±标准差”表示。用SPSS软件11.0统计分析，比较各时间点淋巴细胞转化、抗体效价和免疫器官指数的差异性。死亡率和攻毒保护率用t检验比较各组之间的差异。

2 结果与分析

2.1 淋巴细胞增殖的变化

各时间点D570 nm值均显著高于空白对照组（P<0.05）。[HJ1.3mm]OAPH、OAPM、OMH、OMM、APSH、APSM在各时间点，OAPL和APSL在21、28、35、42日龄，OML在21、28、42日龄的D570 nm值显著高于免疫对照组。

OAPH在各时间点D570 nm值均显著高于OMH和APSH（P<0.05）；OAPM在28日龄D570 nm值高于APSM，但差异不显著，其余各时间点D570 nm 值均明显高于OMM和APSM（P<0.05）；各复方组和OMH、APSH在21日龄D570 nm值达到高峰，其余各单味药对照组在28日龄达到高峰（表1）。

2.2 抗体效价的变化

各时间点抗体效价均显著高于空白对照组（P<0.05）；OAPH、OAPM在14日龄，OAPH、OAPM、OAPL、APSH、APSM、APSL、OMH、OMM在21日龄，OAPH、OAPM、OAPL、OMM和APSM在28日龄，OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在35

日龄，OAPH、OAPM、APSM在42日龄抗体效价显著高于免疫对照组（P<0.05）。

OAPH的抗体效价在各时间点均显著高于OMH和APSH（P<0.05）；OAPM抗体效价在21、28、35、42日龄显著高于OMM，在21、28、35日龄显著高于APSM（P<005）；OAPL抗體效价在28日龄显著高于OML（P<0.05，表2）。

2.3 免疫器官指数的变化

2.3.1 法氏囊指数的变化

OML、OPAL免疫对照组和空白对照组的法氏囊指数在21日龄达到峰值，其他各组在28日龄达到峰值；各药物组及免疫对照组法氏囊指数均显著高于空白对照（P<0.05）；OAPH、OAPM、OMM、OML、APSH、APSM、APSL在各时间点，OMH在21、28日龄，OAPL在14、21、28日龄法氏囊指数显著高于免疫对照组（P<0.05）。OAPH的法氏囊指数在各时间点均显著高于OMH，在28、35日龄显著高于APSH，OAPM的法氏囊指数在35日龄显著高于APSM（表3）。

2.3.2 脾指数的变化

OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在各时间点，OMH在14、35日龄，OML、APSL在14、21、35日龄脾指数显著高于空白对照（P<0.05）；OAPH、OAPM、OAPL、OMM、APSH、APSM在各时间点，OML在21日龄，APSL在14、21日龄的脾指数均显著高于免疫对照组（P<0.05）。

OAPH在各时间点均显著高于OMH，OAPM在21、28、35日龄显著高于OMM，在28日龄显著高于APSM，OAPL在14、28日龄显著高于OML（表4）。

2.4 攻毒保护率的变化

攻毒后24 h，鸡出现精神萎靡，蹲伏笼角；食欲减退或废绝，垂头缩颈，羽毛松散、粗乱，翅膀下垂，闭眼昏睡，伸颈张口呼吸等症状，少数病鸡出现神经症状；腹泻，排黄白色或黄绿色水样粪便。48 h开始出现死亡，72～96 h各组死亡数均达到高峰，随后开始下降，至攻毒后192 h停止死亡。死亡的鸡剖检，可见典型的新城疫变化，喉头、气管有多量黏液，黏膜有出血点或出血斑；腺胃黏膜肿胀，乳头出血；盲肠扁桃体肿大、出血；肠管严重出血；脾肿大、出血。

各组保护率极显著高于空白对照组（P<0.001）；OAP高、中剂量组保护率显著高于免疫对照组（P<0.05），APS的高、中、低浓度、OM中、低浓度保护率均高于免疫对照组，由高到低依次为OAPM、OAPH、APSH、APSM、OMM、OAPL、OML和APSL（表5）。endprint

3 讨论

3.1 中药成分复方及其组分药对淋巴细胞增殖的影响

淋巴细胞增殖是反映机体细胞免疫水平的一个重要指标[9]。细胞免疫是通过致敏淋巴细胞与相应抗原作用而发挥抗病原体感染、抗肿瘤、帮助B淋巴细胞产生抗体等作用。本试验结果表明，9个试验药物组中，除OAPL、OML、APSL在14日龄，OML在35日龄外，其余各组、各时间点的D570 nm值均显著高于免疫对照组。说明复方、APS和OM在合适的剂量下均能刺激淋巴细胞增殖，促进细胞免疫，其中以OAPM、OAPH的效果最好。

3.2 中药成分复方及其组分药对新城疫疫苗免疫应答的影响

血清抗体效价反映机体体液免疫状态[10]，体液免疫是机体抗御感染的主要因素之一，通过抗原-抗体结合反应而起到抗菌、抗病毒、抗外毒素等多种作用。本试验结果表明，OAPH、OAPM和APSM在5个时间点，OMM在4个时间点，OAPL和APSH在3个时间点，OMH和APSL在1个时间点的抗体效价显著高于免疫对照组。表明OAP、APS和OM在合适的剂量下均能刺激抗体产生，提高机体体液免疫水平，其中以OAPH、OAPM和APSM的作用最强。

3.3 中药成分复方及其组分药对免疫器官指数的影响

一般认为，免疫器官指数降低为免疫抑制所致，而免疫器官指数增加则为免疫增强的表现[11]。在本试验中，OAPH、OAPM在各时间点法氏囊指数、脾指数均明显高于免疫對照和空白对照组，OAPL在14、21、28日龄法氏囊指数和各时间点的脾指数显著高于免疫对照组。除OMH在14、35日龄以及OAPL在35日龄法氏囊指数高于免疫对照但差异不显著外，其余各药物组法氏囊指数均显著高于免疫对照组（P<0.05）。在脾指数方面，OMH在各时间点，OML在14、28、35日龄，APSL在28、35日龄外，其余各组、各时间点均显著高于免疫对照组（P<0.05）。表明中药成分复方及其组分药能增加免疫器官质量，从而增强机体的免疫功能。

3.4 中药成分复方及其组分药对免疫保护力的影响

攻毒保护率直接反映动物的抗病力，中药可直接杀灭侵入机体的病毒，或通过增强疫苗的免疫应答而提高保护率[12-14]。本试验将各组鸡在69日龄用NDV强毒进行攻毒，OAPH、OAPM的保护率分别达到91.82%、95.72%，显著高于免疫对照组（P<0.05），APS的3个浓度组、OMM、OML和OAPL的攻毒保护率也高于免疫对照组，表明OAP及中药组能显著提高或提高新城疫疫苗的免疫应答，从而提高雏鸡对新城疫的抗病能力。

3.5 复方及其组分药增强免疫作用有一定的量效关系

本试验发现，OAP增强免疫作用有一定的量效关系。在促进T淋巴细胞增殖方面，OAPH、OAPM在各时间点均显著高于免疫对照组，而OAPL在14日龄则与免疫对照组无显著差异。OM和APS的高、中剂量组在各时间点与免疫对照组相比差异显著，而低剂量组在14日龄与免疫对照组无显著差异，是否因为剂量过小，不足以刺激机体产生致敏淋巴细胞，还有待于进一步研究；在提高血清抗体效价方面，OAPH、OAPM在各个时间点均显著高于免疫对照组，OAPL在21、28和35日龄显著高于免疫对照组；在提高法氏囊指数方面，OAPH、OAPM各时间点显著高于免疫对照，OAPL在14、21、28日龄显著高于免疫对照，在35日龄与对照组相比较差异不显著。孔祥峰等在观察9种中药成分对新城疫Ⅳ系疫苗免疫雏鸡血清中血凝抑制抗体水平的影响，也得到相似的结果[15-16]。

3.6 复方增强免疫作用优于单味组分药

OAP是由OM和APS组成的复方，其增强免疫作用优于单味组分药，表明2种组分药有协同作用。在促进T淋巴细胞增殖方面，OAPH在各时间点D570 nm值均显著高于OMH和APSH（P<0.05）。OAPM在28日龄D570 nm值高于APSM，但差异不显著，其余各时间点D570 nm值均显著高于OMM和APSM（P<0.05）。Wang等观察当归多糖、黄芪多糖及其复方等对培养的鸡脾脏淋巴细胞增殖、抗体生成、细胞因子分泌的影响，也得到相似结果[17-18]。Fan等研究中药成分黄酮及其复方增强免疫作用时也发现，复方的作用效果优于单味成分[19]。

在提高血清抗体效价方面，OAPH抗体效价在各时间点均显著高于OMH和APSH（P<0.05）；OAPM抗体效价在21、28、35、42日龄显著高于OMM，21、28、35日龄显著高于APSM（P<0.05）；OAPL抗体效价在28日龄显著高于OML（P<0.05）。

在提高免疫器官指数方面，OAPH的法氏囊指数在各时间点均显著高于OMH，在28、35日龄显著高于APSH；OAPM的法氏囊指数在35日龄显著高于OMM和APSM；在提高脾指数方面，OAPH在各时间点均显著高于OMH，OAPM在21、28、35日龄显著高于OMM，在28日龄显著高于APSM，OAPL在14、28日龄显著高于OMM。表明2种组分药有协同作用。

综合以上结果可见，OAP能显著增强雏鸡对新城疫疫苗的免疫应答，中、高剂量的效果较好，显著优于单味组分。鉴于中、高剂量的效果多差异不显著，推荐临床使用OAP中剂量配合疫苗使用，可作为新型免疫增强剂的候选方。

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