黄小忠+谢正林+许俊齐+张宝珍

摘要： 通过蝉花僵虫体、子座芽、孢子3个部分的分离培养，利用单因素和正交试验，优化生产虫草酸各营养因子的最佳种类和配比，以达到蝉花真菌的分离及液体发酵培养基的优化效果。结果表明，分离得到的蝉花真菌为拟青霉属蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae （Miquel.） Samson]；工艺优化后得出蝉花液体发酵最佳培养基配方为蔗糖40 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L；生物量和虫草酸总产量能分别提高1.852 g/L、17.774 mg/g。

关键词： 蝉花真菌；分离培养；液体发酵；工艺优化；培养基优化

中图分类号： S567.3+90.43 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0153-03

蝉花（Cordyceps cicadae）别称蝉虫草、蝉茸、胡蝉等，主要产于江浙一带丘陵竹林中，云南和四川等地也有分布。蝉花药性甘寒、无毒，《本草纲目》记载“蝉花可治疗惊痫，夜啼心悸，功同蝉蜕”。蝉花中含有丰富的氨基酸、蛋白质、真菌多糖等生理活性物质，具有镇痛退热、镇静明目、降低血压、抗疲劳、抗肿瘤及提高免疫力的功效[1]。蝉花一般生长在针阔混交林带，山峦平缓起伏，生态环境优良，分布满山遍野的毛竹林，阴蔽较好的林地都有金蝉花，尤其在向阳坡地的竹林下，落叶和腐殖层很厚，透气、透水、保温，密布粗壮、浓白的菌丝体[2-4]。

由于野生蝉花生长环境被破坏及滥采现象严重，导致当前野生蝉花资源日益减少，另外人工采集野生蝉花劳动强度大，其作为中药材走向国际市场存在功能活性组分不明、原料不纯等问题[5-6]。本研究通过用蝉拟青霉[Paecilomyces cicadae （Miquel.） Samson]的分离培养，优化液体发酵工艺来生产菌丝体，旨在解决以上资源短缺及产品品质等问题。

1 材料与方法

1.1 蝉花来源

蝉花标本采集于江苏省句容市磨盘山海拔高度200～400 m的竹林中，冰袋低温保存新鲜金蝉花，24 h内处理。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

甘露醇标准品、Nash（乙酸铵、冰醋酸、乙酰丙酮）、高碘酸钠、L-鼠李糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、麸皮、蛋白胨、酵母膏、豆粉、酪蛋白、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2。

1.2.3 仪器

水浴恒温振荡器（SHZ-28A，江苏省太仓市华美生化仪器厂）；电子天平（KF6102，浙江凯丰集团有限公司）；千分之一精密电子天平（JA5003N，上海精密科学仪器有限公司）；立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；数显恒温水浴锅（HH-4，江苏省金坛市杰瑞尔电器有限公司）；可见分光光度计（WFJ-7200，上海尤尼柯仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 培养基

1.3.1.1 分离培养基

土豆15.00%，葡萄糖2.00%，蛋白胨0.20%，KH2PO4 0.10%，MgSO4·7H2O 0.05%，琼脂粉 1.50%；pH值自然，121 ℃灭菌30 min。

1.3.1.2 母种培养基

土豆20.00%，葡萄糖2.00%，蛋白胨0.15%，KH2PO4 0.10%，MgSO4·7H2O 0.05%，琼脂粉 1.50%～2.00%；pH值自然，121 ℃灭菌30 min。

1.3.1.3 液体菌种培养基

土豆20.00%，蔗糖5.00%，豆粉0.50%，KH2PO4 0.50%，MgSO4·7H2O 0.05%；pH值自然，121 ℃灭菌30 min。

1.3.2 蝉花真菌的分离培养

1.3.2.1 僵虫体分离

无菌水浸泡虫体10 min搅拌出泥沙，0.1%氯化汞溶液浸泡2～3 min，75%乙醇棉球擦拭，无菌水漂洗3次；取虫体前段，切开外壳，取血腔菌丝3～4 mm，接入分离培养基[2]；于28 ℃培养48 h，分离培养去杂菌，移入试管斜面培养并低温保存。

1.3.2.2 子座芽分离

取子座芽，无菌水洗净，0.1%氯化汞溶液浸泡2～3 min，无菌水洗净，取中间3～4 mm组织块接入培养基，置于28 ℃培养48 h，挑取少量菌丝分离培养去杂菌，移入试管斜面培养并低温保存。

1.3.2.3 孢子分离

取无菌纸袋套住蝉花（花蕾），反复振荡，使孢子黏附到袋壁上，将纸浸入25%葡萄糖液中，洗孢子，混匀。取0.1 mL原液，加入1.0 mL无菌水，1.0 mL 01% NaOH，2～3 min后加入无菌水，离心洗涤3次，加入25%葡萄糖溶液，28 ℃培养。每天镜检，孢子萌发后，微吸管吸取单个孢子滴于平板中培养。

1.3.3 种子发酵液培养

1.3.3.1 菌种活化

将保藏的金蝉花菌种无菌操作接种至试管斜面上，25 ℃下培养5～7 d，此时菌丝长满斜面，即可使用。

1.3.3.2 种子液制备

从斜面上取大小相近的0.5 cm×0.5 cm 的母种块，接种于液体培养基中（菌塊要薄，稍带培养基，尽量使菌块漂浮在液面上），每瓶接种3块。装液量为40%，培养温度为25 ℃，转速为180 r/min，一级种培养3 d，二级种在与一级种同样条件下培养2 d。

1.3.3.3 发酵培养

装液量为40%，接种量为10%，培养温度为25 ℃，转速为180 r/min，培养48 h，静置16 h。每个试验3次重复。250 mL三角瓶分装，100 mL/瓶。endprint

1.3.4 液体培养基优化工艺

1.3.4.1 碳源筛选

以豆粉2.00%、KH2PO4 0.10%、MgSO4·7H2O 0.05%为基础培养基，分别加入3.00%的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇5种碳源，pH值自然，于25 ℃、180 r/min 恒温水浴摇床培养5 d，分别对比这5种碳源对生物量及虫草酸含量的影响。其中，豆粉煮沸20 min，经过滤取滤液加入。

1.3.4.2 氮源筛选

以蔗糖2.00%、可溶性淀粉1.00%、KH2PO4 0.10%、MgSO4·7H2O 0.05%为基础培养基，分别将蛋白胨、酵母膏、麸皮、酪蛋白、豆粉5种氮源以2.00%的量加入，pH值自然，于25 ℃、180 r/min恒温水浴摇床培养5 d，分别对比这5种碳源对生物量及虫草酸含量的影响。其中，麸皮经煮沸水解10 min后，经过滤取滤液加入。

1.3.4.3 无机盐筛选

以蛋白胨2.00%、蔗糖2.00%为基础培养基，分别加入0.05%的KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2 5种无机盐，pH值自然，于25 ℃、180 r/min恒温水浴摇床培养5 d，分别对比这5种碳源对生物量及虫草酸含量的影响。

1.3.4.4 生物量的测定

采用细胞干重法[7]，取液体培养后发酵液，用100目尼龙纱网过滤得菌丝体和胞外液，并用蒸馏水反复冲洗，至滤出液澄清为止，收集菌丝体，60 ℃烘干至恒质量，称质量。

1.3.4.5 虫草酸含量测定

取样品液1 mL，用高碘酸钠比色法[8-9]在420 nm处测吸光度，制作甘露醇标准曲线见图1，并计算样品中的虫草酸含量（mg/g）=C×50/m。式中：C为提取液中的虫草酸含量（mg/mL）；50是样品提取液体积（mL）；m为称取样品的质量（g）。

1.3.4.6 不同因素和水平正交试验优化研究

培养温度 25 ℃、初始pH值自然、接种量10%、接种菌龄4 d、摇床转速180 r/min、培养时间5 d，在碳源、氮源、无机盐单因素试验基础上，进行4个因素4个水平[L16（44）]正交试验设计考察，具体设计见表1。发酵结果经极差和方差分析，找出各种培养基成分的最佳浓度和它们对蝉花生物量和虫草酸含量的影响程度。

1.3.4.7 验证试验

将正交试验所获得的最佳培养工艺条件进一步验证，并设置对照，比较优化培养基与基础培养基同条件下蝉花真菌生物量及虫草酸含量的差异。

1.3.4.8 数理统计方法

试验数据用SPSS进行统计分析，并进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 蝉花真菌的分离与鉴定

僵虫体、子座芽和孢子3种来源的组织材料均可以分离得到蝉花真菌。子座芽和孢子的分离效果较好，杂菌污染率较低，菌落生长48 h左右即可见，起初星状放射生长、菌丝平伏，菌丝逐渐呈白色绒毛状，菌落白色、圆形隆起，表面有细小水珠，之后中间颜色加深，呈紫色，初步鉴定为拟青霉属的蝉拟青霉。僵虫体分离染菌率较高，分离效果略差。

2.2 蟬花真菌液体培养基优化结果

2.2.1 蝉花真菌液体培养基的碳源筛选

由表2可知，在5种碳源中，葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖和乳糖都能得到较高的生物量，而虫草酸含量最高的是甘露醇，由于标准品的主要成分是甘露醇，所以适合的碳源是蔗糖，虫草酸的含量是28148 mg/g。

2.2.2 蝉花真菌液体培养基的氮源筛选

由表3可知，不同氮源对虫草酸含量及生物量的影响较大。在5种氮源中，蛋白胨和豆粉对蝉花液体发酵虫草酸含量的影响比较明显，但是豆粉在碳源筛选中作为基础培养基中的氮源，对氮源筛选有一定干扰，所以合适的氮源是蛋白胨，其生物量为 1.361 g/L，虫草酸含量为 32.284 mg/g。

2.2.3 蝉花真菌液体培养基的无机盐筛选

由表4可以看出，5种无机盐对生物量的影响不是很大，但根据虫草酸含量可以看出，MgSO4·7H2O和KH2PO4、K2HPO4能同时获得高产量的虫草酸。值得注意的是，CaCl2的添加反而抑制了虫草酸的产生。基于钾（K）、磷（P）、硫（S）、镁（Mg）作为微生物生长所需的营养元素和虫草素产量考虑，同时选用 MgSO4·7H2O、KH2PO4为培养基中的无机盐组分，保证微生物能更好生长。

2.3 蝉花真菌液体培养基的正交试验结果

从表5直观分析可以看出，培养基的成分对蝉花液体发酵产生生物量的影响顺序为蔗糖>蛋白胨>KH2PO4>MgSO4·7H2O，最优水平为A3B4C1D1，即蔗糖30 g/L、蛋白胨25 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

培养基成分对蝉花液体发酵产生虫草酸含量的影响顺序为蔗糖>蛋白胨>KH2PO4>MgSO4·7H2O，最优水平为A4B2C3D1，即蔗糖40 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。在上述优化条件下，蝉花生物量和蝉花虫草酸含量都要比正交试验最高组（第10组）高。由以上分析可知，蝉花生物量和虫草酸含量呈正相关，生物量的大量产生是虫草酸积累的基础。

2.4 基础培养基和改良培养基验证试验结果

从表6可知，在验证试验中，工艺优化后蝉花生物量和虫草酸含量都有所提高，优化后生物量提高1.852 g/L，虫草酸含量提高17.774 mg/g。说明优化后各种适宜浓度的营养因子能更好地促进生物量和虫草酸的产生。

3 结论与讨论endprint

碳源优化试验中培养基中加入豆粉、麸皮效果较好，可能与向真菌寄主体内提供类似的激素等促进因子有关。在本研究中，蝉花菌株的生长和虫草酸产生的最佳碳源是蔗糖，也有用葡萄糖作为小试发酵碳源的报道，但从生产成本来看，蔗糖更适合工业生产。氮是有机体的重要组成元素，本试验中有机氮源比无机氮源能获得更高的生物量和代谢产物，优化后以15 g/L蛋白胨添加量作为氮源获得总的虫草酸含量达到44.317 mg/g，说明适量的蛋白胨可促进虫草酸的产生。有报道发现，添加NH4+不仅能够成倍地增加虫草酸含量，同时还在一定程度上提高了胞外多糖的产量[10]。无机盐在蝉花的生长和虫草酸的产生中起着重要作用。本试验中添加的几种无机盐均能提高虫草酸的产量，Ca2+效果较不明显，可能影响虫草酸的积累。

从蝉花液体发酵过程分析可知，蝉花真菌的分离、菌种的纯化、液体菌种的培养等因素对生物量和虫草酸的总产量都有很大的影响，更重要的是液体发酵培养基的优化对培养的碳源、氮源、无机盐、温度、摇床的转速等必要因素的考察更具有价值，这也为进一步提高蝉花发酵生产虫草酸和优质菌丝体的生产效率提供参考，对提高经济效益有重要的意义。

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