李晓刚+李慧+杨青松+蔺经+常有宏

摘要： 为探索杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）bHLH转录因子家族的序列特征及表达特点，以8叶期杜梨幼苗为材料，克隆获得2个bHLH转录因子bHLH122-1和bHLH122-2，采用qPCR方法研究它们在非生物胁迫下的表达情况。结果表明，bHLH122-1和bHLH122-2开放阅读框为1 302 bp和1 251 bp，编码的蛋白分别含433个和416个氨基酸残基，分别与苹果的MdbHLH122的同源性最高（83.49%和93.51%）。bHLH122-1和bHLH122-2主要在叶中表达，盐、干旱以及渗透胁迫均能诱导PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的表达，但它们对ABA处理并无转录响应。此外，PbbHLH122-2对上述逆境的应答要早于PbbHLH122-1，而PbbHLH122-1的表达量大于PbbHLH122-1。综上所述，bHLH122-1和bHLH122-2均参与杜梨叶片对非生物胁迫的防御机制，该机制不受ABA信号调控，并且PbbHLH122-1和PbbHLH122-2在逆境条件下发挥的作用可能略有不同。

关键词： 杜梨；bHLH122转录因子；非生物胁迫；表达特征

中图分类号： S661.201 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0040-06

bHLH（basic Helix-Loop-Helix，堿性-螺旋-环-螺旋）转录因子是真核生物中广泛存在的一大类转录因子，通过特定的氨基酸残基与靶基因相互作用，进而调节相关基因的表达[1]。bHLH转录因子家族成员在植物中数量众多，为仅次于MYB类转录因子的第二大基因家族[2]。例如，bHLH转录因子在拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组中为147个[3-4]，在水稻（Oryza sativa）中有167个[5]，菜豆中为155个[6]。bHLH转录因子广泛参与植物叶片花青素合成[7]、光周期对花期的调控[8]、果实的发育成熟[9-10]，以及缺铁条件下根的应激反应[1，11]等多种生命活动。除此之外，研究表明bHLH基因家族中部分成员在植物适应逆境过程中发挥重要作用，例如，拟南芥的AtbHLH122表达受干旱、高盐、渗透等非生物胁迫强烈诱导，超量表达AtbHLH12可显著提高转基因植株的抗逆能力[12]；在野生稻（Oryza rufipogon）Dongxiang中过量表达OrbHLH001，可显著提升植株耐盐和耐寒能力[13]；分析菜豆155个bHLH转录因子在高盐条件下的表达情况发现，其中16个基因在根部和叶片中的表达量均有显著升高[6]。

杜梨（Pyrus betulaefolia Bunge）具备良好的耐旱、耐寒、耐涝等特性，为梨生产中广泛选用的砧木之一，其抗逆分子机制已成为目前的研究热点之一[14-17]，但bHLH转录因子在杜梨抗逆机制中的研究尚未见报道。本研究选取杜梨幼苗为材料，克隆获得2条与拟南芥AtbHLH122同源的PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的DNA和cDNA序列，并用定量PCR分析2条基因在不同非生物胁迫条件下的表达情况，探明杜梨PbbHLH122-1和PbbHLH122-2对非生物胁迫的转录响应，从而为进一步研究它们在杜梨逆境响应过程中的功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试杜梨的成熟种子采集于山东泰安，试验所用材料为8叶龄杜梨幼苗。脱落酸（ABA）、氯化钠（NaCl）、聚乙二醇（PEG-6000）和甘露醇（Mannitol）购自Sigma公司，RNA plant plus Reagent和Pfu DNA Polymerase购自天根生化科技（北京）有限公司，SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit、PowerScript ⅡTM反转录酶和SYBRPremix ExTaqTMⅡ购自宝生物工程（大连）有限公司，AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司，所有引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的克隆 取经 100 mmol/L NaCl处理6 h的杜梨8叶龄幼苗，叶片总RNA 用RNA plant plus Reagent提取，基因组DNA采用CTAB法提取。按照PowerScript ⅡTM反转录酶和SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit说明书将总RNA反转录为cDNA第一 链。采用Liu等报道的在逆境处理中表达量显著提高的拟南芥（Arabidopsis thaliana）转录因子（NCBI 登录号：NP_564583.1） 作为模板[12]，通过tblastN方法在NCBI数据库中（将Organism限定为Pyrus）搜索获得2条与其高度同源的梨属植物白梨（Pyrus×bretschneideri）基因LOC103967841和LOC103963544 。根据上述2条基因序列，分别设计引物 7841-F（5′-ATGGAATCGGATCTTCAGCAGCAT-3′）/7841-S（5′-CTACTGCTGCTTGTTTGAACAGGT-3′）和3544-F（5′-ATGGAATCAGATCATCAGCAGCAT-3′）/3544-S（5′-CTACTGCTGCTTGTTTGAGCAAGT-3′）用Pfu DNA Polymerase扩增编码区的cDNA和DNA序列。PCR反应体系为：buffer 2 μL、cDNA 2 μL上下游引物各0.8 μL、ddH2O 14.2 μL，Pfu DNA Polymerase 0.2 μL，总计20 μL。PCR反应参数为：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR特异产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，连接、转化并PCR验证阳性菌株后，送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。endprint

1.2.2 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的生物信息学分析 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的核苷酸翻译采用BioXM软件，利用Gene StructureDisplay Server（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php）分析内含子和外显子组成[18]。使用ExPaSy-ProtparamTool（http：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸基本理化特性。氨基酸序列比对采用DNAMAN软件完成，Conserved Domains Search Service（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析保守域。用PSORT（http：//psort.ims.ut-okyo.ac.jp /form.html）进行亚细胞定位预测。MEGA 5.0构建系统进化树。SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD（http：//nhjy.hzau.edu.cn/kech/swxxx/jakj/dianzi/Bioinf7/Expasy/Expasy8.htm）预测蛋白的二级结构，SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）预测并繪制三维立体结构。所用序列均来自NCBI（（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。

1.2.3 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2表达研究 选择长势健壮、大小一致的杜梨8叶龄幼苗分别置于含100 mmol/L NaCl、10% PEG-6000、180 mmol/L Mannitol或20 μmol/L ABA的1/4改良MS营养液中，处理0、0.5、1、3、6、9、12 h后，分别收集叶片和根，保存于-70 ℃冰箱待用。以各处理或对照样品的2 μg总RNA逆转录成cDNA第一链，利用PbbHLH122-1和PbbHLH122-2跨内含子特异性引物 7841-E-F（5′-GAGCTTGTACCGAACATGGACAAG-3′）/7841-E-S（5′-CTACTGCTGCTTGTTTGAACAGG-3′）和 3544-E-F（5′-AGCTTGTACCAAACATGGACAAG-3′）/3544-E-S（5′-CTACTGCTGCTTGTTTGAGCAAG-3′），在Bio-rad荧光定量CFX96TM PCR仪进行实时定量PCR。选用PbActin基因引物qPBactS（5′-AACGGACATCAAGCCAAAAA AA-3′）/qPBactA（5′-CAGTTAGCACGCAATTCAGCCA-3′）为内参。反应体系为：SYBR荧光染料10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL、ddH2O 6.4 μL，总计20 μL。反应条件为95 ℃ 30 s；95 ℃ 20 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 10 s，40个循环。按照2-ΔΔCT法计算出待测基因相对表达量，应用Excel 2003整理试验数据并作图。

2 结果与分析

2.1 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2 基因特征

以经100 mmol /L NaCl处理6 h的杜梨8叶龄幼苗叶片cDNA为模板，以7841-F/7841-S为引物，克隆获得1条长度为1 302 bp的cDNA序列，编码1条含有433个氨基酸的多肽，命名为PbbHLH122-1；以3544-F/3544-S为引物，克隆获得1条长度为1 251 bp的cDNA序列，编码1条含有416个氨基酸的多肽，命名为PbbHLH122-2。以DNA为模板，以7841-F/7841-S为引物，克隆获得1条长度为 2 105 bp 的DNA序列；以3544-F/3544-S为引物，克隆获得1条2 056 bp的DNA序列。对扩增得到的cDNA序列和对应的DNA进行分析发现：PbbHLH122-1和PbbHLH122-2基因均由6个外显子和5个内含子组成（图1）。序列比对表明杜梨的PbbHLH122-1与白梨（Pyrus × bretschneideri）的

LOC103967841序列完全一致，而PbbHLH122-2与白梨的LOC103963544序列完全一致，因此不再登陆新的基因序列。

2.2 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的生物信息学特征

运用ExPaSy-Protparam Tool对PbbHLH122-1和PbbHLH122-2编码蛋白的理化性质进行了预测。PbbHLH122-1分子式C2 014H3 180N612O669S19，分子量 47.29 ku，预测的等电点（pI）为6.27，亲水性为-0.775，表明此蛋白为亲水性蛋白，脂溶性较差。PbbHLH122-2分子式C1 926H3 028N580O645S19，分子量45.23 ku，预测的等电点（pI）为5.86，亲水性为-0.758，表明此蛋白为亲水性蛋白，脂溶性较差。由表1可见，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2所编码的多肽相似性为84.63%。PbbHLH122-1和PbbHLH122-2分别与苹果的MdbHLH122的同源性最高（83.49%和9351%）。利用DNAman对拟南芥（NP_564583）、苹果（XP_008352410）、大豆（XP_003540708），芝麻（XP_015571362）、枣子（XP_015876019）的bHLH122基因编码的蛋白进行多序列比对分析，发现PbbHLH122-1和PbbHLH122-2与拟南芥等其他植物的bHLH122转录因子在C端存在着明显的保守区域。利用Conserved Domains Search Service（CD Search）对PbbHLH122-1和PbbHLH122-2进行保守结构域的分析，PbbHLH122-1在C端366～417位氨基酸（PRSIAERV RRTRISERMRKLQELVPNMDKQTNTSDMLDLAVEYIKDLQTQV Q）存在1个HLH结构域，而PbbHLH122-2在C端349～400位氨基酸（PRSIAERVRRTRISERMRKLQELVPNMDKQA HTSDMLDLAVE YIKDLQTQVQ）也存在1个HLH结构域，结果如图2所示。endprint

系统进化分析结果表明，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2与苹果的MdbHLH122的亲缘关系最近，与豆科的大豆以及苜蓿的bHLH122也处于同一个进化分支上，表明它们有较近的亲缘关系（图3）。二级结构分析表明（图4），PbbHLH122-1 中α螺旋占27.94%，无规则卷曲占68.59%，延伸链占 3.46%，而PbbHLH122-2中α螺旋占 30.53%，无规则卷曲占66.11%，延伸链占3.37%。PbbHLH122-1和PbbHLH122-2在C端均有明显的连续α螺旋，与保守结构域的分析完全一致。利用SWISS-MODEL自由匹配模板，预测拟南芥AtbHLH122、PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的C端保守域的3维结构（图5），可以看到三个蛋白C端保守域均含有1个螺旋-环-螺旋结构，仅在“环”位置上有微小差异，根据结构决定功能的原理，推测PbbHLH122-1和PbbHLH122-2与拟南芥AtbHLH122会有相似的功能。

2.3 PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的表达特点

正常生长条件下，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2在杜梨的根和叶中都有表达，其中叶中的相对表达量显著高于根部，而PbbHLH122-1 的表达量略高于PbbHLH122-2（图6）。盐胁迫条件下，PbbHLH122-1 在6 h后达到表达高峰（图7-A）， 而PbbHLH122-2 的表达高峰在1 h之后便已出

现 （图7-B）；PEG-6000模拟干旱胁迫条件下，PbbHLH122- 1直至12 h才出现表达高峰（图7-C），而PbbHLH122-2 在 3 h 出现高峰（图7-D）；甘露醇处理条件下，PbbHLH122-1 于处理9 h后出现表达高峰（图7-E），而PbbHLH122-2 仍是在3 h就出现表达高峰（图7-F）；ABA处理条件下，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2 的表达量在12 h内均无显著变化（图7-G、图7-H）。综上所述，盐、干旱以及渗透胁迫均能提高PbbHLH122-1和PbbHLH122-2的表达量，PbbHLH122-2的相对表达量虽然不及PbbHLH122-1，但是其[CM（25]到達表达峰值的时间均比PbbHLH122-1 早，由此表明，2 个基因在杜梨应对非生物胁迫过程中所发挥的作用可能有所区别，并且它们所参与的信号途径不受ABA调控。

3 讨论

bHLH转录因子家族成员蛋白质C端都具有螺旋-环-螺旋的碱性保守功能域，该区域由2个含有疏水性氨基酸的偶极性α螺旋组成，第一个α螺旋也称识别螺旋，与识别蛋白结合特异的DNA序列有关；第二个α螺旋位于第一个α螺旋之上，基本上平行于双螺旋链，这种结构有利于氢键形成和范德华力作用，对于DNA结合至关重要[19]。这2个bHLH蛋白通过结合到下游基因的启动子上来调控下游基因的表达。本研究中克隆获得的2个杜梨bHLH转录因子，生物信息学分析发现它们所编码的蛋白在C端都具有螺旋-环-螺旋保守功能域。然而，并不是所有的bHLH基因家族成员只[CM（25]在蛋白质C端拥有保守结构域，例如云南红皮梨的1；个bHLH转录因子（HM622265） 除了在C端具有螺旋-环-螺旋保守功能域外，在N端也拥有bHLH-MYC保守结构域[20]。不同的结构决定不同的功能，云南红皮梨bHLH转录因子（HM622265） 主要参与了果实成熟过程中对果皮着色的调控作用，而PbbHLH122-1和PbbHLH122-2 则极有可能只参与植株对逆境条件的响应。

bHLH家族基因在逆境条件下被诱导表达的条件差异很大。例如，棉花的GhbHLH130 在逆境胁迫条件下，显著受高盐、干旱、ABA、低温胁迫的迅速诱导，而GhbHLH1 能够迅速响应ABA处理和干旱胁迫，却不受高盐和低温的影响[21]。本研究中，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2 同源性为 84.63%，在C端都具有螺旋-环-螺旋保守功能域，表明其具有相似的功能，其表达规律也相似。然而，其在对逆境响应的过程中仍然具有一些差异。在高盐、干旱以及渗透胁迫条件下，PbbHLH122-2在1～3 h内即可达到表达峰值，而PbbHLH122-1通常需要6～12 h才能达到表达峰值。然而，从表达量上来看，PbbHLH122-1在上述条件下的相对表达量要略高于PbbHLH122-2。由此表明，PbbHLH122-1和PbbHLH122-2在逆境条件下发挥的作用可能略有不同。

在植物中，转录信号的级联在植物激素ABA和非生物胁迫的信号通路之间组成了一个复杂的信号网络，转录因子在其中发挥了重要作用[22-23]。然而，拟南芥中AtbHLH122显著受高盐、干旱和甘露醇的诱导，而ABA则不能诱导其表达，表明其可能直接调控逆境响应基因，而并不是通过ABA代 谢途径参与植株抗逆活动[12，24]。本研究中无论是PbbHLH122-1 还是PbbHLH122-2均对ABA胁迫无响应，表明与AtbHLH122具有相似的功能特点。

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