徐亚维+李福新+薛建+王霞

摘要： 利用冷休克表达载体构建含有人胸腺肽α原（proTα）编码基因的质粒并在大肠杆菌单一蛋白生产（SPP）系统中表达单一的可溶性蛋白。以proTα mRNA基因序列为模板敲出ACA序列，设计并合成proTα-lessACA目的基因片段后，直接克隆到原核冷休克表达载体pColdⅡ（sp-4）上，将pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA质粒转化到Escherichia coli BL21感受态细胞中，筛选阳性克隆后采用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶双酶切鉴定。共转pMazF质粒后，采用冷休克方法表达proTα并采用SDS-PAGE检测鉴定。结果成功构建重组表达质粒pCold Ⅱ（sp-4）- proTα-lessACA，经冷休克表达后在E. coli BL21（DE3）菌中获得大量单一的proTα。原核表达质粒pCold Ⅱ（sp-4）- proTα-lessACA构建和单一proTα在SPP系统中表达的成功，为进一步研究proTα结构和生理功能提供帮助。

关键词： 人胸腺肽α原；单一蛋白生产系统；冷休克表达

中图分类号： Q786 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）22-0038-02

胸腺肽（thymosin）是一组由胸腺组织分泌的具有调节和增强人体细胞免疫功能的生物活性肽，能促使有丝分裂原激活后的外周血中的T淋巴细胞成熟，主要包括胸腺五肽、胸腺肽α和胸腺肽β等[1]。其中由Goldstein等在1977年首次分离获得具有28个氨基酸组成的胸腺肽α1（thymosin alpha 1，Tα1），效果尤为显著[2]，主要分布于胸腺上皮细胞，也存在于淋巴、脑、脾、肺、肾等组织细胞中[3]。Tα1在机体免疫应答中发挥重要作用，可以促进干扰素及各种淋巴介素的分泌，增强自然杀伤细胞介导的细胞毒性，是一种强效的细胞免疫增强剂[4]，广泛应用于治疗抗生素不能有效控制的严重感染，恶性肿瘤所致的免疫功能低下，乙型肝炎、丙型肝炎及其并发症等[5]。Tα1最初从动物胸腺中提取，这种制备方法由于原料来源有限、含量极低、纯化工艺复杂等原因逐渐被淘汰。目前临床上所用的Tα1均为人工化学合成制备，但化学合成生产成本较高，合成的杂质较多，不易纯化，还会造成环境污染[6]。因此，采用基因工程方法制备Tα1势在必行。目前，Tα1虽然通过细菌或酵母菌表达成功[7]，但一直未能真正实现产业化，其主要原因是Tα1分子量太小，难于大量表达和纯化。现有研究表明胸腺肽α原（prothymosin alpha，proTα）在体内被修饰后具有与Tα1相同的作用[8]，故而可以考虑表达分子量较大的proTα作为新的目的蛋白。

单一蛋白生产（single protein production，SPP）系统是近几年以大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）为宿主开发的一种可高效生产单一蛋白的表达系统[9]。该系统中含有一种核糖核酸内切酶MazF，可专一性地识别菌体mRNA中ACA序列并将其切断，将菌体内所有含有ACA序列的mRNA降解，剔除目的基因中的ACA序列全部，而不改变氨基酸序列，其转录的mRNA则不能被MazF所降解。这样在SPP系统中就可以单一地表达目的蛋白，而没有明显的背景细胞蛋白合成。本研究利用冷休克载体pColdⅡ（sp-4）构建含有proTα基因的质粒，并将其与pMazF质粒共转于E.coli BL21（DE3）菌株中，实现单一proTα的高效表达。

1 材料与方法

1.1 质粒和菌株

pMzaF和pColdII（sp-4）購于宝生物工程（大连）有限公司。E. coli BL21（DE3）由笔者所在实验室保留。

1.2 试剂

胰蛋白胨、酵母粉购于Oxiod公司，质粒提取试剂盒（E.Z.N.A.Plasmid Mini Kit I）购于OMEGA公司，限制性内切酶购于宝生物工程（大连）有限公司；SYBRGreenⅠ购于Invitrogen公司，蛋白质分子量标准购于GE有限公司，10 kb GeneRuler DNA Ladder Mix购于Fermentas公司，其他化学试剂均购于北京化工厂。

1.3 主要仪器

DYY-5 型电泳仪（北京市六一电子仪器厂），Universal Hood Ⅱ型凝胶成像仪（美国 BIO-RAD 公司），HZQ-X100型恒温振荡培养箱（黑龙江哈尔滨东联电子技术开发公司），JY99-2D型超声波细胞破碎仪（浙江宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA质粒的构建

根据人源proTα的mRNA序列（GenBank：M14794.1）设计在SPP系统中表达的proTα基因序列，采用E. coli通用密码子将Tα原中的ACA碱基序列敲除并由上海海捷瑞生物科技有限公司合成pGH-proTα-lessACA质粒。将pGH-proTα-lessACA质粒与pColdⅡ （sp-4）质粒用Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后凝胶回收目的基因与载体基因，再用T4 DNA连接酶进行连接。双酶切体系：pGH-proTα-lessACA与pColdⅡ（sp-4）10 μL，10×Buffer 2 μL，Nde Ⅰ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，H2O 6 μL，37 ℃温育4 h。连接体系：双酶切后的proTα-lessACA基因4.5 μL，双酶切后的pColdⅡ （sp-4）1.5 μL，H2O 1.5 μL，10×连接缓冲液1 μL，T4 DNA连接酶0.5 μL，16 ℃连接16 h后凝胶回收pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒。最后将pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒经CaCl2法转化至E. coli BL21（DE3）菌株中，再经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定和酶切鉴定。其表达的proTα的氨基酸序列为MSDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEE AENGRDAPANGNANEENGEQEADNEVDEEEEEGGEEEEEEEE GDGEEEDGDEDEEAESATGK。endprint

1.4.2 proTα在SPP系统中的表达与鉴定

将pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA转入E. coli BL21（DE3）感受态细胞。经氨苄青霉素筛选后，再将pMzaF质粒转入已含有pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒的 E. coli BL21（DE3）感受态细胞，氯霉素筛选后获得共转细胞。采用冷休克表达方法。挑取阳性克隆，接种于5 mL LB培养基（含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm）中，37 ℃振荡培养至D600 nm为0.5左右，接种于100 mL LB（含100 μg/mL Amp和34 μg/mL Cm）液体培养基中，37 ℃振荡培养至D600 nm为0.4左右，加入IPTG（终浓度为1 mmol/L），16 ℃诱导表达5 d。在表达0、8、16、24、48、72、96、120 h时，6 000 r/min离心 10 min 收集菌体，50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）缓冲液洗菌体后离心收集，加入4倍体积50 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）缓冲液重悬超声后的破碎菌体，12 000 r/m离心30 min，上清用0.45 mm滤膜过滤，采用Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳鉴定Tα1的表达[10]。采用考马斯亮蓝法测蛋白表达量，用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为标准[11]。

2 结果与分析

2.1 pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒基因的设计

设计适于在SPP系统中表达的proTα基因序列，采用E. coli通用密码子将proTα中的ACA堿基序列全部敲除，其基因序列见图1。

2.2 pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒的鉴定

构建的pColdⅡ （sp-4）-proTα-lessACA质粒经限制性内切酶Nde Ⅰ和HindⅢ单/双酶切后由1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果说明质粒构建成功（图2）。

2.3 proTα的冷休克表达与鉴定

共转化pColdⅡ（sp-4）-proTα-lessACA质粒和pMazF质粒的E. coli BL21（DE3）受到IPTG诱导后开始表达Tα1。分别收集0、8、16、24、48、72、96、120 h的可溶性蛋白，理论上即为SPP系统表达的纯蛋白，Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳鉴定结果见图3。结果显示，在表达的第2天即可表达较纯的可溶性蛋白，说明Tα1可以在SPP系统成功表达。在诱导120 h后，在上清液中的可溶性蛋白的最终产率为16.27±0.94 mg/L（BSA标准曲线为 y=0.005 26x+0.070 03，r2=0.999 8）。人源性proTα的理论分子量为9.45 ku，而在SPP系统中所表达的proTα由于在其N端增加了转录增强元件（transcription enhancer element，TEE）和6×His标签共11个氨基酸，因此其理论分子量增加至10.97 ku。

3 结论

采用共转法建立的SPP表达系统能够在E. coli中正确高效表达proTα，其产量可达16 mg/L。通过SPP系统表达最终制备获得了大量的proTα，可以省去纯化蛋白的步骤，大大节省了纯化所需的人力、物力和时间。采用SPP系统表达的proTα经RP-HPLC分析，纯度可达97 %以上。采用SPP系统冷休克表达proTα工艺简单，整个过程约在1 周内完成，不需要纯化过程即可获得纯度较高的产品，为利用基因工程方法大量制备proTα提供了一种简便而又切实可行的方法。

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