马丽君，赵桂治，杨 伟，梁佩枫，黑常春

（1.宁夏回族自治区人民医院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004）

JSI-124对宫颈癌SiHa细胞浸润与凋亡影响的实验研究

马丽君1，赵桂治1，杨 伟1，梁佩枫1，黑常春2

（1.宁夏回族自治区人民医院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学，宁夏 银川 750004）

目的 观察JSI-124对宫颈癌SiHa细胞浸润和凋亡的影响。方法 MTT法检测不同浓度JSI-124不同干预时间对SiHa细胞增殖的影响；免疫荧光检测不同浓度JSI-124对SiHa细胞MMP-9表达的影响；电镜检测JSI-124对SiHa细胞凋亡的影响。结果 JSI-124可以抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖，干预效果随药物作用时间延长及药物浓度增加而增强；JSI-124可以抑制宫颈癌SiHa细胞中MMP-9的表达，随药物浓度增加，MMP-9的表达降低； JSI-124可促进宫颈癌SiHa细胞的凋亡。结论 JSI-124可明显抑制宫颈癌SiHa细胞浸润，促进其的凋亡，可能成为治疗宫颈癌的一条有效途径。

JSI-124；SiHa细胞；MMP-9；浸润；凋亡

宫颈癌是临床常见的妇科恶性肿瘤之一，每年新发病例约46万，仅次于乳腺癌，发病率位居女性恶性肿瘤第2位[1]。目前临床上根据患者的自身状况、TNM 分期、组织病理组织学类型、年龄等，主要采取的治疗方式包括手术、放化疗、综合治疗等[2]。但经过传统治疗手段后，患者的生活质量较低，可能出现身体机能下降、恶心、疲乏、失眠、心理障碍、呕吐、盆腔淋巴囊肿、疼痛、便秘等不良反应。JSI-124(葫芦素I)是一类具有良好穿透细胞膜和特异性抑制酪氨酸激酶功能的四环三萜类化合物，对多种恶性肿瘤如胃癌、乳腺癌[3]、宫颈癌、肝癌、白血病等具有抑制作用[4,5]。本研究以宫颈癌SiHa细胞为研究对象，以JSI-124为干预措施，观察JSI-124在体外对宫颈癌SiHa细胞系增殖、浸润、凋亡生物学行为的影响，为今后临床治疗宫颈癌提供一条新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

人宫颈癌SiHa细胞株购自上海中科院细胞库；JSI-124购自CALBIOCHEM公司；胎牛血清、1640培养基均购自GIbco公司；戊二醛固定液、锇酸、醋酸铀、枸橼酸铅购自Hyclone公司；MTT试剂盒购自北京索莱宝生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 SiHa细胞的培养

人宫颈癌SiHa细胞常规培养于含10%胎牛血清的1640培养液中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养。待细胞生长汇合到80%以上时传代。

1.2.2 JSI-124药物的配制

将JSI-124用DMSO充分溶解，保证DMSO终浓度≤0.1‰，配制成1000µM浓度的母液，-20℃避光保存。用新鲜培养基稀释母液，配置成1.25、2.5、5、10、20µM浓度的工作液，避光操作，各浓度已由预实验筛选。

1.2.3 体外药物敏感性实验

收集处于对数生长期的SiHa细胞，调整细胞密度为5×104/mL，接种于96孔板中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养24 h，设置实验组和对照组，每组5个复孔，实验组加入终浓度分别为1.25、2.5、5、10、20 µM浓度的JSI-124。分别培养24、48、72 h；每孔加入5 mg/mL的MTT10µL、培养液90µL，继续培养4 h，在490 nm的波长下，用多功能酶标仪测定各孔的吸光度值（OD值），细胞抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%，绘制不同浓度组的反应曲线。

1.2.4 免疫荧光检测SiHa细胞MMP-9的表达

取对数生长期的SiHa细胞培养于已放入盖玻片的6孔板中，每孔加入2 mL含10%胎牛血清的培养液，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养2 h，取出6孔板，用PBS洗3遍后每孔加入2 mL的无血清培养液，同时用不同浓度的JSI-124进行干预：①空白对照组；②2.5 µM浓度的JSI-124组；③5.0 µM浓度的JSI-124组；④10.0 µM浓度的JSI-124组。处理完毕放入培养箱中培养24 h，取出细胞爬片，进行免疫荧光实验，在Fluo View FV1000荧光显微镜下观察MMP-9荧光结果。

1.2.5 电镜分析检测JSI-124对SiHa细胞凋亡的影响

取对数生长期的SiHa细胞培养于六孔板中，待细胞长满80%时，加入浓度为5µM的JSI-124培养72 h，细胞间距变大，体积缩小，由紧密联系的多边形，变为联系疏松的圆形，部分细胞呈悬浮状态，3000 r/min离心5 min，弃上清，用2.5%戊二醛固定液固定细胞团块，PBS洗涤3次后，1%的锇酸固定2 h，再用 PBS洗涤3次，丙酮、酒精脱水，用环氧树脂浸透包埋，制成超薄切片，使用枸橼酸铅和醋酸铀染色，用透射电镜观察、分析SiHa细胞。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0 统计学软件进行分析，计量资料以“±s”表示，采用t检验，计数资料以例数（n）、百分数（%）表示，采用x2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTT法检测体外药物敏感性实验结果

以1.25、2.5、5、10、20µM浓度的JSI-124分别干预SiHa细胞24h、48h、72h，各实验组细胞抑制率明显上升随时间和浓度而增加，具有时间浓度依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05），结果见表1、图1。

表1 JSI-124干预SiHa细胞后抑制率的比较（±s，n=5）

表1 JSI-124干预SiHa细胞后抑制率的比较（±s，n=5）

浓度分组SiHa细胞抑制率（%）24h48h72h 1.25µM0.05±0.040.20±0.010.50±0.042.5µM0.19±0.020.33±0.010.58±0.065µM0.31±0.020.44±0.040.70±0.0410µM0.55±0.010.85±0.030.91±0.0220µM0.90±0.010.95±0.020.98±0.00

图1 JSI-124干预SiHa细胞浓度及时间关系

2.2 免疫荧光检测SiHa细胞MMP-9的表达结果

免疫荧光检测结果可以看到，MMP-9表达于SiHa细胞的细胞质中，呈蓝色荧光，与空白对照组相比，JSI-124作用后的细胞中荧光强度明显减弱，且随着药物浓度的增加，荧光强度减弱更明显，结果见图2。

图2 免疫荧光检测SiHa细胞MMP-9的表达结果

2.3 电镜分析检测JSI-124对SiHa细胞凋亡影响的结果

电镜分析结果显示，经JSI-124作用细胞后，SiHa细胞细胞体积小为正常细胞的一半，细胞表面的微绒毛消失，而由较多的小球状凸起，胞质深染，胞膜、细胞器膜、核膜均完整，核染色质凝聚，呈斑块或新月状，凝聚于核膜下或核周，胞质内偶见空泡及凋亡小体，结果见图3。

图3 电镜分析检测JSI-124对SiHa细胞凋亡影响的结果

3 讨 论

宫颈癌是目前临床最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率有明显的地域差异，多发生于发展中国家，并在这些发展中国家位于癌症死因的首位。宫颈癌多在 35～40岁和60～70 岁阶段发病，20岁以前少见，但近年有年轻化趋势，严重威胁女性的生命和健康[6]。手术和放疗是宫颈癌常用的治疗手段，疗效肯定，化疗主要用于晚期或复发转移的患者，但是对中、晚期患者的治疗效果迄今仍较差[7]。寻找一条有效的治疗宫颈癌的途径刻不容缓。

本研究中我们首先采用MTT法检测若干不同浓度JSI-124对宫颈癌细胞敏感性，观察JSI-124对SiHa细胞的增殖抑制力。结果显示：各实验组细胞抑制率明显上升随时间和浓度而增加，具有时间浓度依赖性，差异用统计学意义。JSI-124作用后的细胞中MMP-9的荧光强度明显减弱，且随着药物浓度的增加，荧光强度减弱更明显。经JSI-124作用细胞后，SiHa细胞呈现细胞凋亡的表现，这些结果与绝大多数实验结果相吻合。

综上所述，JSI-124可明显抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖和侵袭，促进其凋亡。JSI-124有望成为宫颈癌防治的一条新的有效途径。

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Study on the effect of JSI - 124 on in filtration and apoptosis of cervical cancer SiHacells

MA Li-jun1,ZHAO Gui-zhi1, YANG Wei1, LIANG Pei-feng1,HE Chang-chun2
(1.Ningxia hui autonomous region people's hospital, ningxia yinchuan 750004; 2.Ningxia medical university, ningxia yinchuan 750004,China)

Objective To observe the effect of JSI-124 on in fi ltration and apoptosis of cervical cancer SiHa cells. Methods MTT assay was used to detect the effect of different concentrations of JSI-124 on the proliferation of SiHa cells. The effect of JSI-124 on the expression of MMP-9 in SiHa cells was detected byimmuno fluorescence.The effect of JSI-124 on the apoptosis of SiHa cells was detected by electron microscopy. Results JSI-124 could inhibit the proliferation of cervical cancer SiHa cells, and the effect of intervention was enhanced with the prolongation of drug action and drug concentration. JSI-124 could inhibit the expression of MMP-9 in cervical cancer SiHa cells. With the increase of drug concentration, MMP-9 expression decreased; JSI-124 can promote the apoptosis of cervical cancer SiHa cells. Conclusion JSI-124 can inhibit the in filtration and promote the apoptosis of cervical cancer SiHa cells, which may be an effective way to treat cervical cancer.

JSI-124; STAT3; MMP-9; In fi ltration; Apoptosis

R446.63

B

ISSN.2095-8803.2017.26.045.03

宁夏自然科学基金（项目计划编号：NZ15195）