母予馨，李峻岭

国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院内科，北京100021

第一代表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制药（tyrosine kinase inhibitor，TKI）最常见的耐药机制是EGFR第20号外显子T790M突变，约占60%[1-2]。以奥希替尼为代表的第三代EGFR-TKI，还包括rociletinib、olmutinib、WZ4002、EGF816和ASP8273，能够克服这种耐药。奥希替尼的客观缓解率（objective response rate，ORR）和无进展生存期（progressionfree survival，PFS）分别为61%和9.6个月[3]，但耐药仍不可避免，其耐药机制主要包括C797S突变，人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和间质表皮转化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）扩增，1-磷酸酰肌醇-3-激酶（phosphati dylinositol 3-kinases，PIK3CA）突变，第10号染色体同源丢失（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN），RAS基因-有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路激活，胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）激活等[4]。本文将针对奥希替尼治疗晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）耐药机制的研究现况加以综述，以期为后续治疗的临床应用提供选择依据。

1 EGFR依赖途径

1.1 C797 S突变

EGFR-C797S突变是第三代EGFR-TKI主要的耐药机制。奥希替尼与半胱氨酸C797在ATP结合位点形成共价键，C797S突变影响了共价键的结合，引起EGFR-TKI失去阻断EGFR通路的作用[4]。Thress等[5]首先证实了C797S出现于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者，研究分析了19例奥希替尼获得性耐药患者的外周血标本，发现其中6例患者出现C797S突变（32%）。Ramalingam等[6]对19例进展后患者外周血标本进行检测，发现2例患者出现C797S突变。研究人员在临床前研究中也证实了C797S的出现，并且发现C797S突变所在染色体的基因状态会对后续治疗起指导作用[7]：①存在EGFR敏感突变，如果C797S和T790M突变为反式结构（位于不同等位基因），则肿瘤对第三代EGFR-TKI耐药，第三代和第一代EGFR-TKI联合应用有效。②存在EGFR敏感突变，如果C797S和T790M突变为顺式结构（位于同一等位基因），目前无论是单用第三代EGFR-TKI或者联合第一代EGFR-TKI均无效。而Niederst等[7]的临床前研究发现，表达C797S突变的耐药细胞，85%与T790M呈顺式结构，临床试验中应用奥希替尼治疗后耐药患者的基因检测结果显示，只有1例患者C797S与T790M呈反式结构，其余均呈顺式结构[5]。因此，探索出对这组人群有效的后续治疗方法至关重要，目前针对C797S突变耐药的第四代药物正在研发中。临床前研究显示，L858R/T790M/C797S三突变细胞系部分对cetuximab敏感[8-9]，但并没有在体内研究中获得证实，而对EGFR突变具有高度选择性的变构抑制剂EAI045联合cetuximab在小鼠模型中已对L858R/T790M/C797S突变产生了疗效[10-12]，但对EGFR-C797S/T790M/del19导致的耐药无效[10]。Uchibori等[13]的临床前研究发现，brigatinib对C797S/T790M/del19三突变细胞系有效，可以减少EGFR及其下游信号通路的磷酸化，对C797S/T790M/L858R三突变也有效，但强度小于对C797S/T790M/del19三突变。Uchibori等[13]还探索了其他间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）抑制药，发现只有brigatinib和AP26113类似物对三突变有抑制作用并且C797S/T790M/del19对其敏感性更强，而其他ALK抑制药如TAE684、ceritinib和ASP3026效果不佳。briga-tinib对C797S/T790M/del19三突变的抑制作用同样在小鼠模型中得到了证实，还发现联合应用cetuximab和 brigatinib，cetuximab能提高 brigatinib或AP26113类似物的作用，另一种EGFR抗体——panitumumab，联合brigatinib也得到了相似的效果。③如果一线应用第三代EGFR-TKI后继发T790M阴性、C797S阳性，肿瘤对第三代EGFR-TKI耐药，但仍对第一代EGFR-TKI敏感[7]。Niederst等[7]和Ercan等[9]的临床前研究显示，一线应用第三代EGFR-TKI后可能出现的C797S+/T790M-细胞对吉非替尼或阿法替尼敏感。Godin-Heymann等[14]也发现，厄洛替尼可阻断存在C797S突变的EGFR通路。

1.2 EGFR其他罕见突变

除了C797S，EGFR其他罕见突变也会引起奥希替尼耐药。Zheng等[15]通过对1例奥希替尼治疗患者的动态监测发现了新的EGFR耐药位点：G796D，为了确认G796D突变对奥希替尼的耐药作用，研究者又进行了体外试验，发现G796D突变导致奥希替尼与C797共价结合的空间位阻。突变的D796残基的亲水侧链CH2COOH插入奥希替尼的多脂中心结构，或者是将奥希替尼挤出目前的结合位置，或者是将结合环扭曲影响铰链结合，从而影响奥希替尼与激酶区的紧密结合，产生耐药。除此之外，研究人员在1例患者的大量胸腔积液标本中发现了另一种新的C797突变：C797G，与T790M呈顺式结构，并且与灶性MYC和EGFR扩增有关[16]。还有L718Q和L844V突变，二者都能导致WZ4002和rociletinib耐药[9,17]。而Bersanelli等[17]首次在1例临床应用奥希替尼治疗后耐药的患者中发现L718Q突变。这些罕见突变还有待进一步研究并探索出针对性的靶向药物。

1.3 T790M消失

不少研究发现，第三代EGFR-TKI可能导致T790M突变克隆的减少或消失，从而导致奥希替尼耐药。Piotrowska等[18]进行的一项Ⅰ/Ⅱ期研究，选取12例应用rociletinib患者配对的治疗前和耐药后的组织活检标本，6例患者治疗后出现了T790M的消失，该6例患者中2例出现小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）转化。Thress等[5]的研究显示，15例患者中4例T790M阳性的患者在奥希替尼耐药后的外周血标本中T790M消失，而EGFR敏感突变仍存在并且突变水平较前增高。Chia等[19]对2例患者治疗前后组织标本进行的研究也得到相同的结果，2例患者治疗前后的组织标本均来自于不同部位，可能与肿瘤进展过程中肿瘤的异质性有关。基于这些结果，T790M消失可能是第三代EGFR-TKI治疗后的结果，也是耐药原因，其出现可以单独存在，但更多是与其他耐药机制例如HER2扩增、MET扩增、BRAF V600E突变、PIK3CA突变并存，可能是这些细胞的过度增殖导致[6,20]。

1.4 EGFR扩增

EGFR扩增不仅是第一代EGFR-TKI的获得性耐药机制[1,21]，目前越来越多的研究证实其可能也是第三代EGFR-TKI的获得性耐药机制之一。Piotrowska等[18]的研究发现3例耐药患者的组织标本EGFR扩增，而用药前标本中并未出现。这3例患者仍保留了EGFR敏感突变和T790M突变。Knebel等[22]动态检测了1例应用奥希替尼治疗后耐药的患者，在奥希替尼治疗前和治疗过程中每月留取外周血检测，以探讨其耐药机制，耐药后研究人员发现EGFR-exon19del拷贝数从141增加到4230，即选择性EGFR-exon19del扩增，其扩增水平与临床和影像学进展相平行。因此检测EGFR水平或许可以早期发现获得性耐药。Niederst等[7]进行的体外研究也于厄洛替尼和WZ4002耐药细胞中发现EGFR扩增，证实了这一观点。

2 旁路途径激活

2.1 MET扩增

关于MET扩增，Planchard等[23]首次做了相关报道，在1例应用奥希替尼10个月后肺部病灶进展的患者中发现了MET扩增（cMET/CEP7：5.32），L858R突变存在但T790M消失。Ortiz-Cuaran等[24]在1例rociletinib原发耐药的治疗前组织标本和奥希替尼治疗后耐药组织标本中均发现了高水平的MET扩增。Chabon等[25]的研究中，43例患者应用rociletinib治疗，11例（26%）存在MET扩增，其中7例仅表现为MET扩增，3例合并其他基因的改变，例如PIK3CA和CDKN2A，1例合并HER2扩增，MET拷贝数增加在其研究中最为多见，与Ortiz-Cuaran等[24]的研究有相似的结果。Chabon等[25]还分析了16例治疗前组织标本或外周血标本T790M阳性、MET拷贝数增加的患者，发现这组人群治疗后较不存在MET改变的患者肿瘤缩小不明显，并且中位PFS较短。这一研究表明，第三代EGFR-TKI应用前即存在MET扩增可能与其疗效不佳有关。一些体外实验也为MET扩增可能导致新一代EGFR-TKI原发和获得性耐药提供了证据，并证实了临床观察的结果[24,26-27]。

针对这一耐药机制，联合应用奥希替尼和MET抑制剂或许是一个选择。1例应用奥希替尼9个月后耐药的患者，对比用药前和进展后的活检检测结果，耐药后出现高水平的MET扩增。给予患者MET抑制剂克唑替尼单药口服，2周后呼吸困难症状缓解，1个月后疗效评价为疾病稳定（stable disease，SD）[28]。因此，MET扩增是奥希替尼耐药的潜在因素，对于奥希替尼耐药并存在MET扩增的NSCLC患者，单独或联合应用MET抑制剂或许会是克服这种耐药的有效方法。

2.2 HER 2扩增

Planchard等[23]首次报道了HER2扩增可能是第三代EGFR-TKI的获得性耐药机制之一。1例应用奥希替尼超过12个月后耐药的患者，其耐药后的二次活检肺组织标本中发现HER2扩增，同时EGFR 19缺失、T790M消失，而治疗前标本中未发现HER2扩增。Ortiz-Cuaran等[24]收集了7例患者经奥希替尼（n=5）或rociletinib（n=2）治疗前后的肿瘤组织标本并进行基因检测。2例应用rociletinib的患者原发耐药，应用奥希替尼患者中2例SD，3例部分缓解（partial response，PR），但最终都出现了疾病进展（progression disease，PD）。从用药3周后出现大量胸腔积液的1例应用rociletinib的PD患者的胸腔积液标本及2例SD患者（奥希替尼）治疗前的肺组织标本中均检测出了HER2扩增，认为HER2扩增可能替代了EGFR信号通路，是导致患者对奥希替尼和rociletinib缺乏反应的原因。对此，Ortiz-Cuaran等[24]还进行了体外研究，证实即使HER2低度扩增也会降低NSCLC细胞对奥希替尼和rociletinib的敏感性。关于第一代EGFR-TKI的研究显示，EGFR T790M和HER2互斥[29]，而对于第三代EGFR-TKI，Oxnard[30]对40例应用奥希替尼患者的研究中也得出了相似的结论。这些研究支持了HER2扩增或许会替代EGFR通路并导致奥希替尼等第三代EGFR-TKI耐药。

2.3 PIK 3CA突变

PIK3CA突变占肺腺癌的2%～4%，与其他肿瘤驱动机制共存[31-32]。研究显示，同时存在PIK3CA和EGFR突变的患者中位生存时间短，提示这种协同作用可能是由于下游信号更强的激活[31-32]。Chabon等[25]对在应用rociletinib后获得性耐药的5例患者的检测中发现了两种突变形式，E542K和E545K。其中2例患者仅表现为PIK3CA突变，3例患者还同时存在MET、EGFR、HER2基因的突变。Oxnard[30]的研究也同样发现了PIK3CA E545K突变，提示这一突变可能是第三代EGFR-TKI耐药的潜在因素。

2.4 PTEN缺失

PTEN缺失被认为是第一代EGFR-TKI的耐药机制之一[33]。关于其在第三代EGFR-TKI耐药中的作用，Kim等[34]报道了1例应用奥希替尼治疗的患者，治疗前存在EGFR T790M突变和PTEN缺失，治疗后监测发现肿瘤细胞中PTEN缺失和EGFmRNA表达比例增加。这种缓慢增加的PTEN缺失和EGF过表达或许是该患者应用奥希替尼治疗后进展的原因。

2.5 RAS-MAPK通路激活

KRAS突变被认为是第一代EGFR-TKI耐药机制之一[35]。Ortiz-Cuaran等[24]的研究中1例应用奥希替尼耐药的患者，血液标本中检测出C797S突变，组织标本中检测出C797S突变、T790M消失，并检测到新的KRAS G12S突变，认为奥希替尼对EGFR通路的阻断作用可能会将肿瘤EGFR信号通路减少到一定水平，从而允许KRAS突变细胞的出现。这一观点也得到了Hata等[36]和Unni等[37]的研究证实。Chabon等[25]还观察到另外3种KRAS突变的出现：G12A、Q61H和A146T，都是rociletinib可能的获得性耐药机制，其中只有KRAS G12A突变的1例患者仅存在这一种获得性耐药机制，另2例患者均表现多种耐药机制共存：1例同时存在KRAS Q61H突变/PIK3CA E81K突变/MET D1304H点突变/MET扩增，1例同时存在KRAS A146T/KIT L576P突变。Eberlein等[38]进行的一项关于第三代EGFRTKI获得性耐药的RAS-MAPK通路的临床前研究发现NRAS错义突变NRAS E63K、NRAS拷贝数增加和KRAS拷贝数增加。Oxnard[30]的研究也涉及了RAS-MAPK通路，40例患者应用奥希替尼治疗，其中1例患者T790M消失，并出现BRAF V600E突变。Kim等[34]在奥希替尼治疗后患者中发现MAPK1基因扩增。Ercan等[39]的临床前研究也得到了相似的结果，MAPK1扩增导致WZ4002耐药。

针对RAS-MAPK通路激活导致的耐药，Eberlein等[38]的临床前研究发现NRAS突变和NRAS拷贝数增加的耐药细胞对丝裂原活化的细胞外信号调节激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）抑制剂selumetinib联合EGFR-TKI敏感。Ortiz-Cuaran等[24]的体外研究显示，KRAS突变导致奥希替尼/rociletinib治疗过程中细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）持续磷酸化，肿瘤细胞对药物的敏感性下降，联合应用奥希替尼和MEK抑制剂trametinib可以克服这种机制引起的耐药，而单独应用奥希替尼无法抑制MAPK下游信号通路的激活。Tricker等[40]同样探索了这种联合治疗，发现WZ4002获得性耐药与ERK 1/2的快速再激活有关，第三代EGFR-TKI联合trametinib可以阻止ERK 1/2的再激活，增加WZ4002引起的细胞凋亡，防止WZ4002敏感细胞出现耐药。这些研究结果都支持了MEK抑制剂例如selumetinib和trametinib与新一代EGFR-TKI联合，克服或者推迟EGFR-TKI获得性耐药的出现。一项奥希替尼联合selumetinib的Ⅰ期临床试验正在进行中（NCT02143466），期待其最终结果。

2.6 FGF 2-FGFR 1信号通路激活

成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）是一个多基因家族，属于免疫球蛋白基因家族成员。FGFR1是一种跨膜蛋白质，属于受体酪氨酸激酶，其细胞外段是成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）配体的结合区。FGF也是一个多基因家族，FGF1和FGF2具有刺激成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞生长的生物学活性，FGFR1是它们的高亲合性受体。当FGF与FGFR1胞外段结合后，受体细胞内段酪氨酸激酶活性区首先发生自身磷酸化，然后使受体靶蛋白发生反式磷酸化，通过蛋白质级联反应将配体的信号传递给细胞核，表现为促进损伤修复、胚胎发育、骨骼形成、血管新生和神经再生等功效。这种信号传递是细胞正常生长所必需的，但当FGF自分泌过多时可引起多种疾病。

Kim等[34]在1例应用奥希替尼耐药患者的研究中发现了FGF2-FGFR1通路导致的耐药。奥希替尼耐药肿瘤细胞出现FGFR1扩增，并且与基线相比表达了20倍高的FGF2mRNA。这一耐药机制也在体外试验中得到了证实，即FGF2分泌过多会引起EGFR敏感突变的NSCLC细胞对奥希替尼耐药。

2.7 IGF 1 R异常激活

一项临床前研究显示，在两个对WZ4002耐药的细胞系中发现了异常激活的胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R），伴有胰岛素样生长因子结合蛋白3（insulin-like growth factor-binding protein 3，IGFBP3）的缺失[41]。下调IGF1R以及抑制IGF1R的激活可以使肿瘤细胞恢复对WZ4002的敏感性。这一结果提示，联合应用IGF1R抑制剂和EGFR-TKI或许可以成为克服获得性耐药或者推迟、预防耐药的有效手段。

3 细胞表型转化

3.1 SCLC转化

Piotrowska等[18]第一次报道了2例应用rociletinib后转化为SCLC从而获得性耐药的患者。转化的SCLC仍保持了原始的EGFR敏感突变，但是T790M消失。免疫组化结果显示1例患者出现视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB1）基因突变，而另1例患者未出现。Kim等[34]和Ham等[42]分别在对应用奥希替尼耐药患者的研究中也发现了相同的机制。Ham等[42]报道了2例应用奥希替尼后因转化为SCLC而耐药的患者，PFS分别是14个月和18个月，组织病理结果均显示为SCLC，CD56阳性，基因检测EGFR敏感突变持续存在（1例L858R突变，1例19号外显子缺失），但T790M消失。第1例患者还存在EGFR扩增，但不明确治疗前是否存在。Kim等[34]发现1例患者奥希替尼治疗后肿瘤细胞出现神经内分泌学形态，表达CD56、chromogranin A和synaptophysin，而这些并不存在于治疗前。此例患者基因检测还发现EGFR-T790M突变拷贝数下降，RB1缺失，与Piotrowska等[18]报道的患者类似。

3.2 上皮细胞-间质细胞转化

Walter等[43]首次在体外试验中证实上皮细胞-间质细胞转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）与第三代EGFR-TKI耐药相关。研究培养含有L858R和T790M突变的细胞，并逐步增加rociletinib的剂量直至耐药，发现EMT的基因增加，在耐药克隆中出现vimentin、AXL、ZEB1、CDH5和FN1表达上调，E-cadherin、MIR200B、CLDN4、EPCAM和CLDN7表达下调及间叶细胞成分标志物。耐药细胞克隆中EGFR表达也较原始细胞下调，没有发现额外的EGFR突变。

4 其他

4.1 BIM缺失多态性

BIM是B细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2，BCL-2）家族促凋亡成员之一。激活的BIM主要通过移位于线粒体膜，经不同途径发挥促凋亡作用[44-45]。EGFR-TKI通过BIM上调引起带有EGFR突变肺癌细胞的凋亡，其能编码重要的促凋亡蛋白。东亚人群中BIM基因存在缺失多态性，导致这一人群缺乏促凋亡活性的BIM亚型，即促凋亡蛋白缺失，从而引起对EGFR-TKI的原发耐药或削弱EGFRTKI的临床疗效[46-47]。一些研究已显示，存在BIM缺失多态性的EGFR敏感突变患者，应用吉非替尼或厄洛替尼治疗的PFS短于BIM野生型患者[48]。而BIM缺失多态性对第三代EGFR-TKI的影响还不确定。Tanimoto等[47]的临床前研究发现，BIM缺失多态性的EGFR敏感突变NSCLC细胞也对奥希替尼耐药。组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂可以上调EGFR突变NSCLC细胞中BIM的表达，联合应用奥希替尼和HDAC抑制剂伏立诺他（vorinostat）可以引起存在BIM缺失多态性和EGFR T790M突变NSCLC细胞的凋亡。

4.2 氧化供能途径改变

肿瘤细胞的特点之一是代谢改变，以适应其需求增加的能量和化合物的数量，因此大多数肿瘤细胞表现出增强的糖酵解[49]。除了糖酵解，氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OxPhos）也能产生有效的三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）产物，对肿瘤细胞的生长代谢同样至关重要[50]。Martin等[51]探索了这些代谢改变是否会导致奥希替尼耐药。既往研究显示，应用小分子抑制剂抑制肿瘤进程中起主要作用的激酶基因能减弱肿瘤细胞的糖酵解[52-53]。Martin等[51]进行的临床前研究发现，奥希替尼能有效减少己糖激酶的活性（糖酵解的第一步酶促反应），减弱乳酸的产生（糖酵解的标志），降低硫氧还蛋白互作蛋白（糖酵解的负性调控蛋白）的表达，但在奥希替尼耐药细胞中却没有发现这些改变。因此研究者认为，奥希替尼抑制肿瘤细胞的作用与其抑制糖酵解有关，其耐药细胞的供能不依赖于糖酵解和EGFR通路。同时，研究发现，细胞可以通过调节能量源从葡萄糖到乳糖或半乳糖，使得细胞通过线粒体呼吸产生ATP，从而上调OxPhos，而这种通过半乳糖供能的细胞对奥希替尼不敏感。因此，当EGFR突变肿瘤细胞通过OxPhos而非糖酵解来获取ATP时，细胞对奥希替尼敏感性下降。

针对这一机制，研究者考虑OxPhos抑制剂phenformin或许与奥希替尼有协同作用抑制肿瘤细胞的生长[51]。结果发现，OxPhos活性在EGFR突变未接受奥希替尼治疗的细胞中维持高水平，奥希替尼治疗后，糖酵解受到抑制的细胞高度依赖于OxPhos代谢来获取能量，奥希替尼和phenformin联合治疗能阻止OxPhos所引起的代谢“逃逸”，有效阻止奥希替尼耐药的出现。Martin等[51]还进行了动物体内实验，证实了联合应用奥希替尼和phenformin较单独应用奥希替尼能推迟出现肿瘤复发的时间。另外，既往一些研究显示，联合应用MEK抑制剂能恢复奥希替尼的敏感性。而研究发现，在应用MEK抑制剂selumetinib一段时间后，奥希替尼耐药能再次出现，而联合应用奥希替尼/selumetinib/phenformin能抑制并且延迟这种耐药的出现，主要是由于phenformin的OxPhos抑制作用[38,40]。总之，当EGFR突变肿瘤细胞通过OPhos而不是糖酵解来获取ATP时，细胞对奥希替尼敏感性下降，而对OxPhos抑制剂敏感性增加。奥希替尼与OxPhos抑制剂联合应用能推迟或阻止耐药的出现。

5 小结

第三代EGFR-TKI在晚期NSCLC患者中的疗效显著，但不可避免出现的耐药问题极大地限制了其临床应用。关于其EGFR依赖和非EGFR依赖的耐药机制逐渐被人们发现，因此，在肿瘤进展时再次进行组织活检或收集血浆循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA）明确耐药机制显得尤为重要，这是未来开发新一代EGFR-TKI和新的联合治疗的关键。